無糖發(fā)酵紅豆乳乳酸菌的篩選及馴化

王 麗,董英麗,雙 全

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

無糖發(fā)酵紅豆乳乳酸菌的篩選及馴化

王 麗,董英麗,雙 全*

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

以從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的50株乳酸菌為對象,在無糖LB培養(yǎng)基進行初篩的基礎(chǔ)上,于紅豆乳中以產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力為目標(biāo)值進行復(fù)篩,再對篩選出的菌株進行馴化。結(jié)果表明,50株供試乳酸菌經(jīng)初篩獲得3株生長狀況較好的菌株S2-4、Sc8-1和NM-6。復(fù)篩結(jié)果表明NM-6在紅豆乳中37 ℃培養(yǎng)48 h時其總酸度和游離氨基氮含量分別達到0.27%和1.215 mmol/L。再對菌株NM-6進行馴化后,其總酸度和游離氨基氮含量比馴化前分別提高了59.3%和25.3%。馴化后的菌株在紅豆乳中有更好的適應(yīng)性,增強了菌株的活力,從而有助于提高酸豆乳產(chǎn)品的質(zhì)量。

乳酸菌,無糖培養(yǎng)基,紅豆乳,馴化,篩選

紅豆是一種高蛋白、低脂肪、多營養(yǎng)的功能食品[1],其蛋白質(zhì)含量比禾谷類物質(zhì)高2～3倍,且含有人體必需的8種氨基酸[2]。紅豆中還富含膳食纖維,可通過降低葡萄糖在體內(nèi)的吸收速度來維持餐后血糖的穩(wěn)定,是糖尿病患者食用的理想主食之一[3]。此外紅小豆提取物具有顯著的抗氧化、降高血壓、降膽固醇等作用[4-5]。據(jù)報道,發(fā)酵后的紅豆乳營養(yǎng)價值提高并更易于人體吸收[6]。本實驗為了充分發(fā)揮紅豆乳固有的營養(yǎng)價值及乳酸菌的益生功能[7],以從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌為對象,在無糖LB培養(yǎng)基和紅豆乳中以產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力為指標(biāo)進行篩選,并對其進行馴化。以使菌株能更好的適應(yīng)在紅豆乳中生長。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售紅豆;供試乳酸菌50株(全部乳酸菌來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室提供,從酸菜、奶酪、馬奶酒等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離并初步鑒定的并經(jīng)編號的菌株)。

MRS液體培養(yǎng)基:大豆蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、Tween 80 1 g/L、硫酸鎂200 mg/L、硫酸錳54 mg/L、無水葡萄糖20 g/L,pH6.5,121 ℃ 20 min滅菌。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L,121 ℃ 20 min滅菌。

SW-CJ-2FD潔凈工作臺 上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司;HVE-50全自動立式高壓滅菌器HIRAYAMA;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Thermo CR3i冷凍型多功能離心機、TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅豆乳的制備:挑選新鮮、飽滿、無蟲蛀的紅豆進行搓洗,徹底清除附在豆子表面上的臟污,以干凈清水充分沖洗幾次。然后按紅豆∶水=1∶4浸泡紅豆,水溫30～35 ℃,浸泡時間12 h,用少許5% NaHCO3溶液調(diào)浸泡液的pH至7.5～8.5,用豆?jié){機將浸泡好的紅豆榨汁,制成濃度為4%的紅豆乳,105 ℃滅菌15 min后,然后冷卻至4 ℃?zhèn)溆媒泳鶾8]。

1.2.2 無糖發(fā)酵紅豆乳乳酸菌的篩選

1.2.2.1 乳酸菌在無糖LB培養(yǎng)基中的初篩 將經(jīng)活化好的供試乳酸菌50株,接種于無糖的LB培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,根據(jù)其生長能力OD值的測定初步篩選出優(yōu)勢乳酸菌。

1.2.2.2 乳酸菌在紅豆乳中的復(fù)篩 將初篩乳酸菌按2%接種量分別接種于濃度為4%的新鮮紅豆乳中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,同時將未接菌的4%的紅豆乳置于同樣的條件下37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h作為對照組,分別測定0、24、48 h時其總酸度和游離氨基氮含量,從中選出產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力較強的菌株。總酸度測定參照GB 5413.34-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測定》方法[9]。游離氨基氮測定采用OPA試劑法[10-13]。

1.2.3 篩選菌株的馴化 將篩選乳酸菌在不同比例的LB培養(yǎng)基和紅豆乳的混合培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進行馴化[14-15](LB培養(yǎng)基∶紅豆乳=10∶0;8∶2;5∶5;2∶8),馴化后接入紅豆乳中37 ℃培養(yǎng)48 h,通過測定0、8、16、24、32、48 h不同時間段內(nèi)紅豆乳的總酸度和游離氨基氮含量,比較篩選菌株馴化前后其產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力的變化。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0進行處理,用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 無糖發(fā)酵紅豆乳乳酸菌的篩選

2.1.1 供試乳酸菌在無糖LB培養(yǎng)基中的生長能力 結(jié)果表明絕大部分乳酸菌在無糖LB培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h后的OD值都小于0.50,只有3株乳酸菌S2-4、Sc8-1和NM-6的OD值大于0.50,其OD值對應(yīng)分別為0.568、0.502、0.538(結(jié)果過多未出示)。

2.1.2 篩選菌株在紅豆乳中的產(chǎn)酸能力 將初篩的3株菌接種于紅豆乳中,與對照組相比37 ℃培養(yǎng)不同時段內(nèi)的總酸度含量測定結(jié)果見表1。

由表1可知,3株菌在發(fā)酵紅豆乳中隨著發(fā)酵時間的延長其總酸度比對照組明顯增高,其中菌株NM-6的產(chǎn)酸能力相對較強,在37 ℃培養(yǎng)48 h時的總酸度可達到0.27%,是發(fā)酵前的5.4倍。發(fā)酵0 h和24 h時的總酸度之間差異顯著(p<0.05),而發(fā)酵24 h和48 h時其總酸度之間差異不顯著(p>0.05)。由顯著性分析可得該菌在發(fā)酵24 h以內(nèi)的酸度增長要明顯高于24 h以后時段,說明菌株NM-6的生長對數(shù)期在發(fā)酵24 h以內(nèi)出現(xiàn)。

表1 篩選菌株在不同培養(yǎng)時間的總酸度(x±sd,n=6)

注:同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同字母為差異不顯著(p>0.05),表2、表3同。

2.1.3 篩選菌株在紅豆乳中的蛋白質(zhì)分解能力 根據(jù)OPA試劑法,由L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及其吸光度值制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。以標(biāo)液的濃度對吸光度值(OD值)進行直線回歸,得出回歸方程為y=0.4641x-0.0089,R2=0.9979。

圖1 L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of L-phenylalanine

將初篩的3株菌接種于紅豆乳中,37 ℃培養(yǎng)不同時段內(nèi)的游離氨基氮含量測定結(jié)果見表2。

表2 篩選菌株在不同培養(yǎng)時間的游離氨基氮含量(x±sd，n=6)

由表2可知,3株菌在發(fā)酵紅豆乳中隨著發(fā)酵時間的增加其游離氨基氮含量比對照組有明顯的增長,其中菌株NM-6的蛋白質(zhì)分解能力相對較強,培養(yǎng)48 h后其游離氨基氮含量達到1.215 mmol/L,比發(fā)酵前增加了83.8%,由顯著性分析可得在發(fā)酵0 h和24 h時的游離氨基氮含量之間差異顯著(p<0.05),而發(fā)酵24 h和48 h時其游離氨基氮含量之間差異不顯著(p>0.05)。該菌在發(fā)酵24 h以內(nèi)的游離氨基氮含量的增量明顯高于24 h以后階段,這說明菌株NM-6的蛋白質(zhì)分解能力主要在發(fā)酵前期階段呈現(xiàn)。從產(chǎn)酸和蛋白分解能力綜合判斷,選擇菌株NM-6作為馴化菌株。

2.2 篩選菌株NM-6的馴化

2.2.1 菌株NM-6在紅豆乳中的適應(yīng)性 篩選菌株NM-6在LB培養(yǎng)基和紅豆乳不同比例混合培養(yǎng)基中逐級并連續(xù)傳代馴化結(jié)果見表3。

表3 菌株NM-6在不同比例培養(yǎng)基中pH和酸度的馴化值(x±sd，n=6)

注:同列肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),相同字母為差異不顯著(p>0.05),表4同。

從表3可以看出當(dāng)混合培養(yǎng)基LB∶紅豆乳=1∶1時,總酸度與比例8∶2的組別無顯著性差異(p>0.05),且經(jīng)反復(fù)實驗結(jié)果分析得出在混合培養(yǎng)基(1∶1)中馴化效果較好且酸度較穩(wěn)定,因此后方選擇這個比例進行實驗。

由表3和表4可知,菌株NM-6在馴化培養(yǎng)基中隨著紅豆乳比例的增大,其產(chǎn)酸能力總體呈現(xiàn)下降趨勢,即豆乳比例越大,總酸度越小。將菌株NM-6在混合培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代馴化后,其產(chǎn)酸能力隨著傳代次數(shù)的增加而增強。馴化第1代時的總酸度為0.25%,傳代到第4代時的總酸度為0.42%,傳代到第8代時的總酸度可達到0.55%,各組之間呈現(xiàn)出差異顯著性(p<0.05),到第8代時其總酸度比傳代前提高約2倍并且此時其酸度和pH均可達到穩(wěn)定狀態(tài)。這說明微生物自身具有高度適應(yīng)環(huán)境的能力,當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時,能夠在其細(xì)胞內(nèi)各種酶的協(xié)助下,迅速進行自我調(diào)節(jié),使其形成適應(yīng)于新環(huán)境的代謝系統(tǒng)[14]。

表4 菌株NM-6在混合培養(yǎng)基中的馴化適應(yīng)性(x±sd，n=6)

2.2.2 菌株NM-6的馴化效果

2.2.2.1 菌株NM-6馴化前后產(chǎn)酸能力的變化 馴化前后的菌株NM-6在紅豆乳中培養(yǎng)時的總酸度含量變化情況如圖2所示。

圖2 菌株NM-6馴化前后總酸度含量的變化Fig.2 The total acidity content of strain NM-6 through taming

由圖2可知,在馴化后,菌株NM-6的產(chǎn)酸能力比馴化前均有所提高,在發(fā)酵24 h時的總酸度為0.31%,約是原來的1.4倍,在48 h時的總酸度達到0.43%,約是原來的約1.6倍,這說明菌株NM-6對紅豆乳的適應(yīng)性逐漸增強,產(chǎn)酸能力逐漸增大,呈現(xiàn)出良好的生長趨勢。該菌株經(jīng)馴化后可達到發(fā)酵酸豆奶所要求的酸度(0.3%～0.5%)[14]。

2.2.2.2 菌株NM-6馴化前后蛋白質(zhì)分解能力的變化 馴化前后的菌株NM-6在紅豆乳中培養(yǎng)時的游離氨基氮含量變化情況如圖3所示。

圖3 菌株NM-6馴化前后游離氨基氮含量的變化Fig.3 The free amino nitrogen content of strain NM-6 through taming

由圖3可知,馴化后菌株NM-6在紅豆乳培養(yǎng)過程中游離氨基氮的生成能力比馴化前均有所增加,在培養(yǎng)8 h時的游離氨基氮含量是1.084 mmol/L,比馴化前提高了25.6%,24 h和48 h時的含量分別為1.302 mmol/L和1.387 mmol/L,比馴化前分別提高了27.2%和25.3%。這說明菌株NM-6在紅豆乳中的蛋白質(zhì)分解能力在馴化后有所增強,所生成游離氨基酸或功能性短肽類物質(zhì)的幾率增大。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示,50株供試乳酸菌經(jīng)無糖LB培養(yǎng)基中初篩以及在紅豆乳中復(fù)篩后,獲得了生長能力、產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力較好的菌株NM-6,其總酸度和游離氨基氮含量在37 ℃培養(yǎng)48 h時可分別達到了0.27%和1.215 mmol/L,且研究發(fā)現(xiàn)該菌的生長對數(shù)期出現(xiàn)在24 h段內(nèi),這樣更加有利于縮短發(fā)酵時間,減少成本,有望可以作為無糖發(fā)酵紅豆乳的生產(chǎn)菌株。

為了使菌株更好的適應(yīng)紅豆乳中的生長,使其在LB培養(yǎng)基和紅豆乳不同比例的混合培養(yǎng)基中進行馴化。研究發(fā)現(xiàn)該乳酸菌在LB培養(yǎng)基和紅豆乳混合培養(yǎng)基(1∶1)中逐級傳代的產(chǎn)酸效果和穩(wěn)定性是最好的,馴化后其總酸度和游離氨基氮含量分別達到了0.43%和1.387 mmol/L,比馴化前分別提高了59.3%和25.3%。在無糖條件下發(fā)酵制備的紅豆乳其產(chǎn)酸能力和蛋白質(zhì)分解能力均達到理想的效果,以期為今后紅豆功能性食品的開發(fā)奠定實踐基礎(chǔ)。

[1]趙建京,范志紅,周威.紅小豆保健功能研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報,2009,11(3):46-50.

[2]Chau C F,Cheung P C K,Wong Y S.Chemical Composition of three Underutilized legume seeds grown in China[J].Food Chemistry,1998,61(4):505-509.

[3]王彤.眉豆、綠豆及赤小豆對餐后血糖影響的研究[J].食品科學(xué),2001,22(5):74-76.

[4]孫麗麗,董銀卯,李麗,等.紅豆生物活性成分及其制備工藝研究進展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(4):390-392.

[5]Amarowicz R,EstrelIa,HernANdez T,et al. Antioxidant activity of extract of adzuki bean and its fractions[J].Journal of Food Lipids,2008,15(1):119-136.

[6]許振偉,臧如瑛,楊新超.酸奶生產(chǎn)菌的篩選以及紅豆酸奶的研制[J].山東食品發(fā)酵,2012,165(2):21-26.

[7]梁永海,李鳳林,莊威.紅小豆雙歧桿菌發(fā)酵保健飲料生產(chǎn)工藝的研究[J].冷飲與速凍食品工業(yè),2005,11(4):18-20.

[8]李南薇,李燕杰,朱藝通.凝固型紅豆顆粒酸奶的研制[J].中國乳品工業(yè),2011,39(3):62-64.

[9]黃高明,張建華.紅棗乳酸菌飲料發(fā)酵特性的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2007,121(12):28-30.

[10]P.M.N IELSEN,D.PETER SE N,C.DA M BM AN N. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis[J].Journal of Food Science,2006,66(5):1365-2621.

[11]Andersson R E,Danielsson G,Hedlund C B,et al.Effect of Heat-resistant Microbial Lipase on Flavor of Ultra-high-temperature Sterilized Milk[J].J Dairy Sci,1981,64:375-379.

[12]Jarrett H W,Cooksy K D,Ellis B,et al.The separation of o-phthalaldehyde derivatives of amino acids by reversed-phase chromatog-raphy on octylsilica columns[J].Analytical Biochemistry,1986,153(1):189-198.

[13]Abdul Kabir Khan Achakzai. Effect offertilizer,inoculation and sowing time on free amino acids and mineral nitrogen content of field grown mature soybean seeds[J].Asian Journal of Plant Sciences,2003,2(1):132-141.

[14]陳荷鳳.酸豆奶生產(chǎn)菌種的馴化研究[J].中國乳品工業(yè),1996,24(3):16-18.

[15]趙宇星,周惠明,錢海峰.酸豆乳生產(chǎn)菌種的馴化研究[J].食品科技,2005(11):28-30.

Screening and taming ofLacticacidbacteriain the fermented sugar-free red bean milk

WANG Li,DONG Ying-li,SHUANG Quan*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The growth ability of 50Lacticacidbacteriastrains isolated from the traditional fermented food in Inner Mongolia were screened in the sugar-free LB medium,and acid producing capability and protein decomposition capability were measured as the goal value in the red bean milk. Then the protein decomposition capability of selected strain was tamed gradually. The results showed that the three strains(S2-4,Sc8-1 and NM-6)were screened out with good growth ability,and one of the best strain NM-6 was selected by measuring protein decomposition capability in the red bean milk,and its total acidity and the free amino nitrogen content at 37 ℃ for 48 h were 0.27% and 1.215 mmol/L,respectively. After taming,the total acidity and the free amino nitrogen content of strain NM-6 were improved by 59.3% and 25.3%. The tamed strain had better adaptability in the red bean milk,at the same time the higher strain activity was helpful to improve the quality of soymilk yoghurt products.

Lacticacidbacteria;sugar-free medium;red bean milk;taming;screening

2015-03-23

王麗(1990-)，女，碩士，研究方向：食品工程，E-mail:15024908453@163.com。

*通訊作者:雙全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué),E-mail：shuangquan@imau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31460443)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0186-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.030