高產γ-氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在梨酒釀制中的應用

趙國群,關軍鋒

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.河北省農林科學院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

高產γ-氨基丁酸釀酒酵母的篩選及其在梨酒釀制中的應用

趙國群1,關軍鋒2,*

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.河北省農林科學院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

從梨果實表面篩得到8株既能高產γ-氨基丁酸(GABA),又有較強產酒精能力的酵母菌株,其中菌株KS45產生GABA能力最強,達到了1.146 g/L。經鑒定,菌株KS45為釀酒酵母。當在含有梨汁的發酵培養基中靜置發酵時,釀酒酵母KS45高產GABA,這表明梨汁中可能含有刺激酵母合成GABA的物質。將釀酒酵母KS45接種到鴨梨汁中,30 ℃下靜置發酵10 d,獲得了富含GABA 的梨酒,其中GABA含量達到了2.427 g/L。實驗發現,在富含GABA梨酒發酵過程中,GABA的產生伴隨著酒精的消耗,呈現耦合關系,其機理尚不清楚。隨著發酵溫度的升高,梨酒的最終酒精度顯著降低。裝液量對GABA產生有很大影響。隨著裝液量的增加,梨酒中GABA含量急劇下降,這可能與氧氣供給不足有關。

γ-氨基丁酸,釀酒酵母,梨酒,篩選

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)是一種非蛋白質的天然氨基酸,廣泛存在于植物、動物和微生物中[1]。GABA具有抗衰老、降血壓、改善肝功能、調節激素分泌、改善睡眠、增強記憶力、防治肥胖等重要生理功能[2-3]。GABA主要是通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸脫羧轉化而成的[4]。乳酸菌[5-7]、霉菌[8-9]、酵母菌[10-11]以及其他微生物中均含有這種酶,因此,可通過提取谷氨酸脫羧酶或通過微生物發酵來生產GABA。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,富含GABA的功能性食品已經成為研究和開發的熱點。

目前,采用微生物發酵已經開發的富含GABA食品有發酵乳[12]、清酒[13]、飲料酒[14]、米醋[15]等,但富含GABA 的果酒尚未見報道。梨果肉質細脆,含糖量高,香甜爽口,營養豐富,含有各種蛋白質、礦物質和多種維生素等,是釀造果酒的良好原料[16]。本研究從梨果實表面篩選出了既能高產GABA,又仍有較強產酒精能力的釀酒酵母,并用于梨酒的釀制,獲得了富含GABA的梨酒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨梨、雪梨 河北省趙縣產;溴甲酚綠 天津市百世化工有限公司,分析純;琥珀酸 天津市博迪化工有限公司,分析純;50%乙醛酸溶液 上海源葉生物科技有限公司。

SP-722E型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SPX-250B-II型生化培養箱 上海賀德實驗設備廠;安捷倫6820高效氣相色譜儀 美國惠普公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 YPD培養基：葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母浸粉10 g/L,瓊脂20 g/L,pH自然;GABA篩選培養基[17]：葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,瓊脂20 g/L,溴甲酚綠0.1 g/L,琥珀酸2 g/L,乙醛酸2 g/L,pH自然;WL瓊脂培養基[18]酵母浸粉5 g/L,胰蛋白胨5 g/L,葡萄糖50 g/L,瓊脂 20 g/L,磷酸二氫鉀0.55 g/L,氯化鉀0.425 g/L,氯化鈣0.125 g/L,氯化鐵0.0025 g/L,硫酸鎂0.125 g/L,硫酸錳0.0025 g/L,溴甲酚綠0.022 g/L,pH為6.5;發酵培養基[19]：蔗糖 200 g/L,酵母浸粉10 g/L,硫酸銨 1.0 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,硫酸鎂1.0 g/L pH自然;梨汁發酵培養基：50%鴨梨汁+發酵培養基。實驗所用的鴨梨汁中GABA含量為0.76～1.03 g/L。

1.2.2 酵母的富集培養 選擇糖分含量高、香氣濃、充分成熟、無霉爛果的梨果,去核、不去皮,用螺桿式榨汁機榨汁。分別取100 mL果汁于250 mL錐形瓶中,并加入適量果渣。加入5%亞硫酸鈉溶液,使得果汁SO2濃度為50 mg/L;用8層干凈的紗布封口,放置于30 ℃的恒溫培養箱中培養,直到有酒味產生為止。

1.2.3 高產GABA釀酒酵母的初篩 將發酵后的梨汁進行適當稀釋后涂布到GABA篩選培養基上,于30 ℃恒溫培養箱中培養3 d。觀察菌落顏色和形態,挑取具有酵母形態、綠色較深的菌株進行分離純化。純化菌株保藏于試管斜面,并保存于4 ℃冰箱中。將初篩出的高產GABA菌株,接種YPD液體培養基,活化24 h后接種到WL瓊脂培養基,30 ℃培養3 d后觀察,挑選出淺黃色-綠色、表面光滑、球形突起的、不透明的菌株。

1.2.4 高產GABA釀酒酵母的復篩 將初篩得到的高產GABA菌株,分別接種到100 mL發酵培養基、梨汁發酵培養基中,30 ℃靜置發酵6 d。待發酵結束后測定發酵液中GABA的含量和酒精含量。

1.2.5 高產GABA釀酒酵母的鑒定 將復篩所得到GABA產量最高的酵母菌株KS45,進行賴氨酸培養基鑒定[20],并送交上海生工生物工程股份有限公司進行分子鑒定。

1.2.6 富含GABA梨酒的釀制

1.2.6.1 釀酒酵母種子液的制備 在100 mL YPD液體培養基中,分別接入2～3環斜面保藏的釀酒酵母KS45,30 ℃、180 r/min 搖床培養2 d。

1.2.6.2 梨汁的制備 選擇新鮮無病的成熟鴨梨,清水洗凈、去核后,用螺桿式榨汁機榨汁,并用蔗糖調整其糖度為20%。

1.2.6.3 發酵時間的影響 將150 mL梨汁加入250 mL的三角瓶中,并按10%接種量接入種子液,用8層干凈的紗布封口,在30 ℃下分別靜置發酵4、6、8、10、12 d。

1.2.6.4 發酵溫度的影響 按10%接種量向150 mL梨汁中接入種子液,分別在15、20、25、30、35 ℃下恒溫靜置發酵10 d。

1.2.6.5 裝液量的影響 將制備好的梨汁裝入500 mL三角瓶中,裝液量分別控制為100、200、300、400 mL,接入10%種子液,分別在30 ℃下靜置發酵10 d。

1.3 分析方法

1.3.1 GABA測定 采用Berthelot比色法[21]。每個實驗設置三個平行實驗,測定GABA,取其平均值。

1.3.2 酒精度測定 梨酒蒸餾后,以正丁醇為內標物,采用氣相色譜儀測定其乙醇含量。每個實驗設置三個平行實驗,測定酒精度,取其平均值。

2 結果與分析

2.1 高產GABA酸釀酒酵母的篩選

2.1.1 高產GABA釀酒酵母的初篩 黃麗華等[17]在篩選高產GABA的酵母菌株時,使用了一種含有溴甲酚綠、琥珀酸和乙醛酸的篩選培養基。這種培養基對GABA具有顯色專一性,菌落綠色越深,表明該菌株產生的GABA越多,從而可快速地初篩出GABA高產菌株。課題組曾采用檸檬酸、草酸、乳酸、鹽酸、硫酸、磷酸驗證過其準確性,發現這些有機/有機酸在該篩選培養基上均不顯色,只有GABA顯示出黃綠色,這表明該篩選培養基對GABA具有良好的選擇性和靈敏性。

將自然發酵后的梨汁進行適當稀釋后涂布到GABA篩選培養基上,30 ℃培養3 d,其中一個平板的培養結果見圖1。觀察菌落顏色和形態,挑取出具有酵母形態、綠色較深的菌株進行分離純化,獲得了83株高產GABA酵母菌株。WL培養基對釀酒酵母的篩選可信度達到100%[18]。將上述獲得83株酵母菌株,活化后接種到WL瓊脂培養基,挑選出了67株呈淺黃色-綠色菌株,初步判定其為釀酒酵母。

圖1 不同酵母菌株在GABA篩選培養基上的菌落形態Fig.1 The colonies of different yeast strains on the GABA selecting medium

2.1.2 高產GABA釀酒酵母的復篩 本研究的目的是獲得富含GABA的梨酒,因此,復篩時采用了靜置發酵。將初篩得到的高產GABA酵母菌株分別接種到發酵培養基進行靜置發酵,發酵結束后,檢測其中的GABA和酒精含量。實驗發現,所有酵母菌株均產生不同濃度的酒精,但均檢測不出GABA。分析其原因很可能是由于靜置發酵時氧氣供給太低造成的。與之相反,當將初篩得到的高產GABA酵母菌株在梨汁發酵培養基進行靜置發酵時,發現所有酵母菌株在產生酒精的同時,均可檢測到有不同濃度的GABA產生,這說明梨汁中可能含有刺激GABA合成物質。這些刺激GABA合成物質使得酵母菌能夠在厭氧條件合成了較多GABA。在梨汁發酵培養基上經過復篩,共獲得了8株高產GABA釀酒酵母(表1),其中菌株KS45產生的GABA最多,達到了1.146 g/L。從表1中還可以發現,普通釀酒用的安琪釀酒酵母可以產生酒精,但不產生GABA。菌株KS45在高產GABA的同時,仍具有良好的產生酒精的能力,其發酵酒精度達到8%,因此,本研究采用菌株KS45來釀制富含GABA梨酒。菌株KS45的菌落形態特征為:乳白色,球形突起,表面光滑,不透明,奶油狀(圖2)。

表1 高產GABA酵母菌株的復篩結果

注:表1中GABA產量為酵母菌株產生的凈GABA值。

圖2 酵母菌株KS45的菌落形態Fig.2 The colonies of yeast strains KS45

2.1.3 高產GABA釀酒酵母的鑒定 釀酒酵母不能利用賴氨酸作為氮源,因而在賴氨酸培養基上不能生長。將復篩所得到GABA產量最高的酵母菌株KS45,接種到賴氨酸培養基進行培養,發現菌株KS45不能在賴氨酸培養基形成菌落,因而基本上可確定菌株KS45為釀酒酵母。為了更加準確和可靠,將菌株KS45送交上海生工生物工程股份有限公司進行了分子鑒定。提取KS45菌株的基因組DNA,用通用引物NS1和NS6進行擴增可知18S rDNA 的PCR長度約為1300 bp。經測序,菌株KS45的18S rDNA核苷酸序列大小為1335 bp,與NCBI數據庫序列比對結果顯示:菌株KS45的18S rDNA核苷酸序列與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)18S rDNA(GeneBank登記號為EU011664.1)核苷酸序列一致性達到99%,因此將菌株KS45鑒定為釀酒酵母。

2.2 富含GABA梨酒的釀制

2.2.1 發酵時間的影響 將釀酒酵母KS45接種到梨汁中進行酒精發酵,定時取樣監測梨汁中GABA含量和酒精度的變化,實驗結果見圖3。從圖3中可以看出,在發酵的前4 d,隨著酵母菌體的生長和發酵時間的延長,酒精濃度急劇上升,并在第4 d達到最高值,9.5%;而與此同時,梨酒中GABA含量卻逐漸下降,在第4 d達到最低值,0.88 g/L。在葡萄酒釀造過程中也觀察到類似的現象,可能是GABA用作氮源而被菌體吸收利用[22]。4 d發酵以后,隨著發酵時間的延長,發酵液中酒精度呈近似線性地下降,而GABA含量卻呈近似線性地上升,直至發酵結束。這個結果表明GABA產生的同時伴隨著酒精的消耗,呈現耦合關系,且為負相關。在我們的另外實驗中,發現發酵過程中酒精度的降低并不是由于醋酸菌的醋酸發酵而造成酒精的減少(數據未顯示)。那么,釀酒酵母KS45在合成GABA的同時,為什么消耗乙醇,其機理尚不清楚。參考葡萄酒對酒精度(≥7.0%)要求,因此,富含GABA梨酒的適宜發酵時間為10 d。

圖3 發酵時間的影響Fig.3 The effect of fermentation time

2.2.2 發酵溫度的影響 溫度是影響釀酒酵母生長和酒精發酵的一個重要因素。如圖4所示,當發酵溫度較低(15～25 ℃)時,菌體產生GABA的量很低。發酵溫度為30 ℃時,菌體產生GABA的能力最強,發酵液中GABA濃度達到最大值,2.427 g/L。當發酵溫度升高至35 ℃,菌體產生GABA量顯著下降。胡超等[23]也發現釀酒酵母產生GABA的最適溫度為30 ℃。對于普通梨酒及其他果酒而言,一般是較高發酵溫度下所獲得的酒精度要高于較低發酵溫度,或者發酵溫度對最終酒精度影響不大[24-25]。然而,從圖4中卻發現,隨著發酵溫度的升高,梨酒中酒精度呈顯著下降趨勢。造成這種現象的部分原因可能是:GABA的產生與酒精的消耗呈負相關(見2.2.1);在較低的發酵溫度下,菌株KS45產生的GABA較少,酒精消耗也較少,因而使得梨酒的最終酒精度較高。發酵溫度為35 ℃時,GABA和酒精度均顯著降低,可能是高溫(35 ℃)既抑制乙醇的產生,也抑制GABA的合成。

圖4 發酵溫度的影響Fig.4 The effect of fermentation temperature

2.2.3 裝液量的影響 裝液量的多少直接影響釀酒酵母酒精發酵過程中氧氣的供給。從圖5中可以看出,隨著裝液量的增加,梨酒的酒精度逐漸上升,而梨酒中GABA含量卻急劇下降。關于GABA生物合成的機理研究基本上都集中于乳酸菌,而對釀酒酵母合成GABA的機理國內外都極少研究。關于釀酒酵母合成GABA是否需氧,國內外文獻均沒有明確說明。蔣冬花等[11]、胡超等[23]在搖床發酵研究釀酒酵母產GABA發酵條件時,發現高搖床轉速產生的GABA高于低搖床轉速。結合本研究結果,可初步推斷釀酒酵母生物合成GABA是一個需氧過程。當梨汁裝液量較高時,由于氧氣供給的不足,造成釀酒酵母產生較少的GABA。

圖5 裝液量的影響Fig.5 The effect of broth volume in the fermentor

3 結論

本研究從梨果實表面篩選出了8株既能高產GABA,又有較強產酒精能力的酵母菌株,其中菌株KS45產生GABA能力最強,達到了1.146 g/L。經鑒定,菌株KS45為釀酒酵母。實驗發現,只有在含有梨汁的發酵培養基中,篩選出的酵母菌才能在靜置發酵時高產GABA,這表明梨汁中可能含有刺激釀酒酵母合成GABA的物質。將釀酒酵母KS45按10%接種量接入到鴨梨汁中,30 ℃下靜置發酵10 d,獲得了富含GABA 的梨酒,其酒精度為7.0%,GABA含量達到了2.427 g/L,比發酵前(梨汁)增加了2倍多。實驗還發現,在富含GABA梨酒發酵過程中,GABA產生的同時伴隨著酒精的消耗,呈現耦合關系,其機理尚不清楚。隨著發酵溫度的升高,梨酒的最終酒精度顯著下降。裝液量對GABA產生有很大影響。隨著裝液量的增加,梨酒中GABA含量急劇下降,這可能與氧氣供給不足有關。

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Screening of highγ-aminobutyric acid-yield yeast strains ofSaccharomycesCerevisiaeand application in brewing of pear wine

ZHAO Guo-qun1,GUAN Jun-feng2,*

(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China;2.Institute of Genetics and Physiology,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang 050051,China)

Eight yeast strains which could produce high yield ofγ-aminobutyric acid(GABA)and ethanol were screened from the surface of pear fruits,among which,yeast strain KS45 had the highest capability of GABA production(1.146 g/L). Strain KS45 was then identified asSaccharomycescerevisiae. WhenS.cerevisiaeKS45 was cultivated in pear juice-contained culture media,it could produce high yield of GABA in anaerobic condition,which indicated that pear juice might had compounds that could stimulateS.cerevisiaeKS45 to produce GABA. AfterS.cerevisiaeKS45 was inoculated in Ya pear juice and fermented in a incubator at 30 ℃ for 10 d,pear wine with rich GABA(2.427 g/L)was obtained. It was found that GABA production was coupled with ethanol consumption during the brewing of pear wine,and its mechanism was not clear. The final ethanol concentration of pear wine decreased significantly as the fermentation temperature increased. The volume of culture medium in the fermentor could affect the production of GABA. With increasing of the volume of culture medium,GABA concentration of the pear wine rapidly decreased,and the possible reason was that supply of oxygen was not sufficient.

γ-aminobutyric acid;Saccharomycescerevisiae;pear wine;screening

2015-02-09

趙國群(1963-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術,E-mail:gqzhao18@126.com。

*通訊作者:關軍鋒(1966-),男,博士,研究員,研究方向:果品貯藏加工,E-mail:junfeng@126.com。

國家現代農業[梨]產業技術體系建設專項(cars-29)。

TS255.47

A

1002-0306(2015)23-0173-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.027