微孔板Alamar blue顯色法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的研究

鄭玉紅，郭 倩,3，李 超,4，魏劍浩,4，趙麗麗，蔣 毅，趙秀芹，萬康林，李桂蓮

微孔板Alamar blue顯色法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的研究

鄭玉紅1,2，郭 倩1,2,3，李 超1,2,4，魏劍浩1,2,4，趙麗麗1,2，蔣 毅1,2，趙秀芹1,2，萬康林1,2，李桂蓮1,2

目的 評價微孔板Alamar blue顯色法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的可行性。方法 用微孔板Alamar blue顯色法對78株結核分枝桿菌檢測氧氟沙星的最小抑菌濃度，記錄獲得結果時間，利用ROC曲線確定氧氟沙星的最佳耐藥閾值，并和傳統的藥物敏感性實驗羅氏培養基比例法進行比較。結果 微孔板Alamar blue顯色法獲得結果平均時間為8 d，氧氟沙星的最佳耐藥閾值為2 μg/mL，以羅氏培養基比例法為金標準，氧氟沙星的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%。結論 微孔板Alamar blue顯色法是一種簡便、敏感、快速的藥物敏感性檢測方法，可用于結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的快速檢測。

結核分枝桿菌；氧氟沙星；耐藥性；Alamar blue顯色法

近年來，耐多藥結核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現使結核病控制面臨嚴重的挑戰。我國是一個MDR-TB高負擔國家，MDR-TB病人數占全球的22%[1-3]。2007年全國結核病耐藥性基線調查結果顯示MDR-TB患病率初治病人為5.7%，復治病人則高達25.6%[2]。氟喹諾酮類藥物對結核分枝桿菌具有高度抗菌活性，是MDR-TB聯合治療方案的藥物之一，而且氟喹諾酮類藥物成員莫西沙星作為一線抗結核藥用于減少結核病治療療程的臨床試驗目前正在評估當中[4-5]。然而氟喹諾酮類藥物由于其廣譜抗菌活性，該藥在我國目前廣泛用于非呼吸道感染性疾病已經有20多年的歷史。氟喹諾酮類藥物的濫用可能會使MDR-TB的治療效果不盡如人意。因此快速、準確的對氟喹諾酮類藥物進行藥物敏感性實驗對指導臨床治療、控制結核病流行具有極其重要的意義。

目前臨床上仍廣泛采用羅氏培養基比例法藥物敏感性試驗檢測結核分枝桿菌的耐藥性，藥敏結果獲得需要4～5周，不能及時準確的指導結核病治療。Alamar blue顯色法藥敏實驗是近年興起的表型藥物敏感性檢測方法，與傳統的比例法相比，實驗周期從4～5周縮短至8～9 d，而且操作簡單，可快速測定大量樣本。文獻報道Alamar blue顯色法藥敏實驗用于檢測結核菌4種一線抗結核藥的敏感性具有良好的靈敏度和特異度[6-10]。但是目前關于該方法檢測結核菌氟喹諾酮敏感性的報道較少。現將我們用Alamar blue顯色法檢測結核菌氧氟沙星耐藥性的結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 結核分枝桿菌標準株(H37Rv，ATCC27294)和78株經菌種鑒定為結核分枝桿菌的臨床分離株為本室保存菌株。78株臨床株含經比例法藥敏試驗鑒定的44株氧氟沙星耐藥株和34株氧氟沙星敏感株，具體的耐藥表型見表1。

表1 78株結核分枝桿菌臨床分離株耐藥譜

Note: OF, ofloxacin; INH, isoniazid; RIF, rifampicin; STR, streptomycin; EMB, ethambutol; KAN, kanamycin; CPM, capreomycin; Pan-susceptible strains means that strains were susceptible to all of the above drugs.

1.2 試劑和耗材 Middlebrook 7H9干粉和OADC營養添加劑購自美國BD公司；利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、喹諾酮、卡那霉素和卷曲霉素購自美國Sigma公司；ALamar blue購自英國AbD Serotec公司；滅菌96孔酶標板購自美國Corning公司。

1.3 主要試劑配制 7H9液體培養基配制方法為秤取4.7g 7H9干粉、2 mL甘油，加入到898 mL蒸餾水中，于121 ℃高壓滅菌10 min后置4 ℃冰箱保存。臨用時，加入100 mLADC營養添加劑。Alamar blue顯色劑為臨用前配制。氧氟沙星用滅菌后的1%氫氧化鈉水溶液配成1.28 mg/mL。

1.4 羅氏培養基藥敏比例法 按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行，培養基中藥物終濃度如下：利福平40 μg/mL，異煙肼0.2 μg/mL，鏈霉素4 μg/mL，乙胺丁醇2 μg/mL，卡那霉素30 μg/mL，氧氟沙星2 μg/mL，卷曲霉素 40 μg/mL[11-12]。

1.5 氧氟沙星MIC測定 H37Rv和78株結核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星的MIC檢測采用微孔板Alamar blue顯色法，具體步驟參照文獻[6]。簡言之，先于96孔板每一行的各個孔加入100 μL7H9，然后采用倍比稀釋的方法使氧氟沙星的濃度為64 μg/mL～0.125 μg/mL，同一行的各孔均加入同一菌株的稀釋菌液(濃度為50 μg/mL)100 μL，一個微孔板可以做6株菌株對氧氟沙星的MIC。將上述微孔板在37 ℃的培養箱中培養5 d；從第6 d開始，在空白板中加入70 μL顯色劑(Alarmar blue：5%Tween-80=2∶5)，隔天觀察變色情況。如顏色從藍色變成紫紅色或粉色，則在含藥培養基中加入顯色劑；若沒有變色或變色程度較淺，則繼續在另一對照孔中加入顯色劑，觀察至變色為止。在含藥培養基中加入顯色劑的第2 d，觀察結果并記錄獲得結果的天數。MIC定義為藍色完全沒有發生改變的最小藥物濃度。

1.6 數據分析 微孔板Alamar blue顯色法的準確度利用ROC曲線評價，曲線下面積越大，則認為該方法正確區分氧氟沙星耐藥和敏感的能力越大。ROC曲線可給出區分耐藥和敏感的最佳耐藥閾值，當ROC曲線下面積為1時，該閾值可正確的將耐藥和敏感完全分開，當面積小于或等于0.5時，該閾值不能將敏感和耐藥分開。金標準為改良羅氏比例法。ROC數據分析采用統計軟件包SPSS16.0進行。

2 結 果

2.1 氧氟沙星MIC值檢測結果 78株菌株氧氟沙星的MIC值見表2。44株氧氟沙星耐藥菌株中，39株菌株氧氟沙星的MIC值在2 μg/mL及以上，MIC值最高為64 μg/mL；其余5株中4株菌株MIC值為1 μg/mL，1株菌株為0.5 μg/mL。34株氧氟沙星敏感菌株中2株MIC為2 μg/mL，2株為1 μg/mL，2株為0.5 μg/mL，14株為0.25 μg/mL，其余12株≤0.125 μg/mL。

利用ROC曲線分析，曲線下面積為0.981，P值為0.000，氧氟沙星的最佳耐藥閾值為2 μg/mL。此時Alamar blue顯色法的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%，見表3。

表2 78株結核分枝桿菌氧氟沙星MIC檢測結果

Note: OF, ofloxacin.

表3 微孔板Alamar blue 顯色法檢測結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的敏感度和特異度分析Tab.3 Sensitivity and specificity of Microplate Alamar blue assay for ofloxacin susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis

Note: MABA, Microplate Alamar blue assay; the breakpoint of ofloxacin resistance was ≥2 μg/mL for Microplate Alamar blue assay.

2.2 檢測時間 本研究共檢測78株臨床菌株對氧氟沙星的耐藥性，共有60株菌株8 d獲得結果，12株9 d獲得結果，6株10 d獲得結果。平均時間(中位數)為8 d。

3 討 論

由于結核分枝桿菌耐藥問題日益嚴重[13]，因此快速、簡便、準確的藥物敏感性檢測方法的出現就顯得尤為重要。多個文獻報道ALamar blue(刃天青)顯色法檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇藥物敏感性的靈敏度和特異度均在97%以上[6-10]。本研究用微孔板Alamar blue顯色法測定結核分枝桿菌對氧氟沙星的最小抑菌濃度，并與羅氏比例法進行比較。

本研究結果顯示，以比例法作為金標準，氧氟沙星的耐藥閾值為2 μg/mL時，Alamar blue顯色法的靈敏度和特異度分別為88.6%和94.1%。王芝等人用微量液體培養基MIC快速法檢測220株結核菌發現靈敏度和特異度分別為90.8%和96.5%[14]。而Bactec MGIT960藥敏系統檢測結核菌的靈敏度和特異度分別介于71.2%～95.2%和91.5%～95.7%[15-16]。由此可見，Alamar blue顯色法可以較準確的判斷結核菌株的藥物敏感性。此外，本方法既可以獲得結核菌株的藥敏檢測結果，還可獲得藥物的MIC值，從而了解菌株的耐藥水平高度，為指導臨床治療用藥提供細致可靠的依據。

結核分枝桿菌是一種慢速生長菌，由此給結核病的快速診斷以及藥物敏感性的快速檢測帶來了保礙。目前WHO推薦的用于結核分枝桿菌喹諾酮類藥物耐藥性診斷的方法有羅氏培養基比例法和Bactec MGIT960藥敏系統，但羅氏培養基比例法獲得結果的平均時間為28 d，遠遠高于本法需要的時間8 d，和Bactec MGIT960藥敏系統的10 d差不多[15]。而Bactec MGIT960藥敏系統儀器及試劑價格昂貴，限制了其在中等及資源貧乏的國家和地區的應用。然而本研究利用微孔板進行實驗，對實驗室設備設施以及實驗人員的生物安全知識要求較高，建議在螺旋蓋的培養管中進行實驗以提高安全性。總之，Alarmar blue顯色法是一種簡便、敏感、快速、低廉的藥物敏感性檢測方法，可用于結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥性的快速檢測。

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s: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn;LI Gui-lian, Email: LiguiLian@icdc.cn

Rapid determination on resistance of ofloxacin forMycobacteriumtuberculosiswith microplate alamar blue assay

ZHENG Yu-hong1,2,GUO Qian1,2,3,LI Chao1,2,4,WEI Jian-hao1,2,4, ZHAO Li-li1,2,JIANG Yi1,2,ZHAO Xiu-qin1,2,WAN Kang-lin1,2,LI Gui-lian1,2

(1.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 2.CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,Hangzhou310003,China; 3.PathogenicBiologyInstitute,SouthofChinaUniversity,Hengyang421000,China; 4.WenzhouMedicalCollege,KeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,MinistryofEducation,Wenzhou325035,China)

We assessed the feasibility of microplate alamar blue assay for determining the ofloxacin resistance ofMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis). MIC of ofloxacin of 78M.tuberculosisisolates was determined by microplate alamar blue assay and the time of obtaining the results was recorded; receiver operating characteristic (ROC) curve was used to determine the resistant threshold value of ofloxacin, and compared to the conventional proportional method. Results showed that the resistant threshold value of ofloxacin was 2 μg/mL for microplate alamar blue assay, and compared to the gold standard proportional method, the sensitivity and specificity were 88.6% and 94.1%, respectively. And the time obtaining the results for microplate alamar blue assay was 8 days. Microplate alamar blue assay is simple, sensitive and rapid, and is a promising alternative method for rapidly determining the resistance of ofloxacin ofM.tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; ofloxacin; resistance; alamar blue assay

萬康林，Email：wankanglin@icdc.cn； 李杜蓮，Email：LiguiLian@icdc.cn

1.傳染病預防控制國家重點實驗室，傳染病預防控制所，中國疾病預防控制中心， 北京 102206； 2.感染性疾病診治協同創新中心，杭州 310003； 3.南華大學病原生物學研究所，衡陽 421000； 4.溫州醫學院，醫學檢驗省部共建教育部重點實驗室，溫州 325035

Supported by the project of the National Key Program of Mega Infectious Disease (No. 2013ZX10003006-002-001)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.009

R378.91

A

1002-2694(2015)06-0537-04

2014-12-29；

2015-03-30

國家重大傳染病專項課題(No.2013ZX10003002-001)，(鄭玉紅，郭倩有同等貢獻)