塞來昔布對細粒棘球蚴原頭節生長及 p-ERK2 表達的影響

王 勃，姜玉峰，李芳芳，王 卓，邢國強，雷 穎，史紅娟 ，張示杰，彭心宇，呂海龍

塞來昔布對細粒棘球蚴原頭節生長及 p-ERK2 表達的影響

王 勃1，姜玉峰2，李芳芳1，王 卓1，邢國強1，雷 穎2，史紅娟2，張示杰1，彭心宇1，呂海龍1

目的 探索塞來昔布對細粒棘球蚴原頭節體外生長及p-ERK2表達的影響。方法 實驗分組為1640培養基組、DMSO組、塞來昔布溶液(50、100、150、200 μmol/L)中體外孵育，在倒置焦鏡下觀察原頭節的形態變化，同時通過0.1%伊紅染色顯示原頭節活力。運用Western blot檢測DMSO、100、150、200 μmol/L塞來昔布處理細粒棘球蚴原頭節48 h后p-ERK2蛋白的表達量。結果 體外孵育7 d后，DMSO組及空白1640對照組原頭節的活力幾乎沒有改變。塞來昔布作用1 d后，100、150、200 μmol/L組原頭節的活力均下降；作用3 d后，200 μmol/L組原頭節全部被殺死，150 μmol/L組的原頭節活力為43.9%。100 μmol/L、50 μmol/L組對原頭節的活力也有明顯下降，但不及高濃度組顯著。Western blot結果顯示P-ERK2的表達量隨濃度增加而下降趨勢明顯。結論 塞來昔布能夠抑制細粒棘球蚴原頭節生長，這可能與塞來昔布下調P-ERK2的表達進而抑制ERK2信號傳導通路有關。

塞來昔布；細粒棘球蚴；原頭節；ERK2通路

細粒棘球蚴病是一種危害嚴重的人獸共患病，在我國主要分布在畜牧地區[1]。目前對包蟲病的治療,手術仍然是主要的手段[2]，但術中易造成包蟲囊腫囊液外溢，以及未殺死的原頭節殘留于手術創面或腹腔，這是導致手術后復發最主要的原因[3-4]，如果能尋找一種能在短時間內殺死頭節又對周圍正常組織損傷小的藥物用于術后局部使用，有可能對預防復發起到有效的作用。

本研究以自然感染的綿羊肝細粒棘球蚴原頭節為研究對象，觀察塞來昔布對綿羊細粒棘球蚴原頭節生長的影響，進一步評價塞來昔布用于臨床抗包蟲治療的可能性，為塞來昔布在肝包蟲病治療的臨床應用提供依據。

1 材 料

自然感染細粒棘球蚴病的綿羊肝臟，由新疆石河子市西部牧業有限公司提供，塞來昔布(西樂葆)購自美國輝瑞制藥有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，RPMI 1640培養基購自上海哈靈生物科技有限公司，小牛血清購自杭州四季青生物有限公司，山羊抗小鼠p-ERK2抗體購自Santa Cruze公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體購自Santa Cruze公司。塞來昔布膠囊內容物用DMSO充分溶解，0.22 μmol/L濾器過濾備用(DMSO最終濃度<0.1%)。

2 方 法

2.1 細粒棘球蚴原頭節的分離及體外培養 將新鮮的自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟帶回實驗室，生理鹽水沖洗肝臟表面，洗干凈后移入無菌超凈臺內用75%酒精消毒表面，用無菌方式抽取囊內容物置培養瓶中，靜置數分鐘使育嚢和原頭蚴沉淀后棄去上清液，用PBS液反復沖洗去掉死亡的原頭蚴，保證原頭節活力大于98%(0.1%伊紅染色)，然后體外培養原頭節3 d，待適應體外環境后藥物作用。

2.2 實驗分組 本實驗共計6組：培養基對照組、DMSO組及50、100、150、200 μmol/L的塞來昔布作用組。將體外培養的細粒棘球蚴原頭節再次用PBS洗滌數次，使原頭節活力接近100%，用RPMI 1640培養基混勻原頭節。每組培養液中加入約2 000個原頭節，置37 ℃、10%O2、5%CO2條件下培養，每隔24 h取作用后的頭節80～100個，測活力并計數。隔3 d換培養液及復加藥1次，連續觀察7 d。實驗獨立重復3次。

2.3 Western blot檢測蛋白定量表達 取100、150、200 μmol/L 塞來昔布作用48 h組，DMSO組的細粒棘球蚴原頭節為對照，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3遍，棄掉上清液，在電子天平中各組稱取質量為10 mg的細粒棘球蚴原頭節，加入150 μL RIPA裂解液，用超聲粉碎儀迅速使原頭節粉碎，置于冰上裂解15 min。然后移入高壓過且在冰上預冷的1.5mL EP管中，置4 ℃離心機中離心，12 000 g，25 min，離心畢，小心抽取各管中的上清液置新的EP管中。提取總蛋白,測定蛋白含量并配平為統一濃度, 每個泳道蛋白的溶液體積5 μL,上樣于SDS-PAGE凝膠進行電泳分離后,轉移至PVDF膜, 5%BSA(內參用5%牛奶)均用TBST配制, 在常溫下封閉2 h。 一抗(β-actin，P-ERK2)效價均為1∶1 000，4 ℃孵育18 h, TBST洗膜6次×5 min,隨后加辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗小鼠效價為1∶25 000)室溫下脫色搖床上搖動孵育2 h，漂洗同上。 暗室內加入化學發光劑顯影，用膠片曝光并采圖, 用凝膠圖像處理系統分析目的條帶。

2.4 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗及χ2檢驗，均以P<0.05為有統計學意義。

3 結 果

3.1 光鏡下觀察塞來昔布作用后的細粒棘球蚴原頭節形態變化 倒置顯微鏡下觀察，塞來昔布作用24 h后，各實驗組均可見蟲體不同程度的回縮，隨藥物濃度的增加外翻的原頭節比例明顯增加，體積變小。作用3 d后，各藥物作用組原頭節蟲體邊緣出現不同程度的損傷，邊緣不規整，頂突外翻、小勾排列不齊、部分斷裂脫落，蟲體內鈣顆粒數量減少、體積減小，頂突下方吸盤清晰可見，形態不規則。可見大部分頭節因結構破壞被染成紅色。空白對照組原頭節頂突內陷,伊紅染色拒染,可見原頭節活動。

3.2 塞來昔布對細粒棘球蚴原頭節生長的影響 不同濃度塞來昔布作用后的細粒棘球原頭節活力曲線見圖2。經χ2檢驗，各濃度塞來昔布作用組的原頭節活力值與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。DMSO組7 d后活力為(95.5±0.5)%，培養基對照組作用7 d后活力為(96.5±0.3)%，差異無統計學意義(P>0.05)。200 μmol/L 塞來昔布作用原頭節24 h后，活力僅為(3.1%±0.7%)。

Av Control protoscoleces B: Protoscoleces were incubated with DMSO; C: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 100 μmol /L celecoxib;D: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 100 μmol /L celecoxib; E: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 150 μmol /L celecoxib;F: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 150 μmol /L celecoxib; G: Altered protoscoleces after 1days p. i. with 200 μmol /L celecoxib;H: Altered protoscoleces after 3 days p. i. with 200 μmol /L celecoxib

圖1 光鏡細粒棘球絳蟲原頭節的(100×)(0.1%伊紅染色)

Fig.1 Light microscopy of E. granulosus protoscoleces(100 ×)

從活力曲線圖(圖2)看出，隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長，塞來昔布對原頭節的抑制率增加，即藥物對原頭節的抑制作用具有劑量依賴性和時間依賴性。

圖2 不同濃度塞來昔布作用后細粒棘球蚴原頭節活力曲線

Fig.2 Survival ofE.granulosusprotoscoleces afterinvitroexposure to celecoxib

3.3 塞來昔布對p-ERK2蛋白表達的影響 Western blot法檢測DMSO及100、150、200 μmol/L塞來昔布作用原頭節48 h后 P-ERK2蛋白表達(圖3),以ERK磷酸化程度作為評估塞來昔布對原頭節體內該信號通路活性影響的指標。本實驗中測得各組p-ERK2及內參β-actin蛋白的灰度值,以P-ERK2/β-actin灰度比值進行P-ERK2蛋白表達水平的相對半定量分析，顯示不同濃度塞來昔布(100、150、200 μmol/L)處理細胞48 h后, p-ERK2蛋白表達量均下降，并呈現明顯的濃度依賴性,組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度塞來昔布作用細粒棘球蚴原頭節48 h后磷酸化ERK2蛋白的表達

Fig.3 p-ERK2 protein expression inEchinococcusgranulosusprotoscolices following treatment with celecoxib at different doses for 48h

4 討 論

新疆是肝細粒棘球蚴病的高發地區[5]，目前該病已被列入國家轉移支付項目區免費救治疾病。目前手術治療是該病的重要治療方式，但術中頭節的外溢難免導致術后復發，因此術中運用有效的局部化療藥物輔助治療是防止復發的關鍵措施。目前臨床肝包蟲術中和術后常用的輔助化學藥物有20%的食鹽水，10%過氧化氫，1.5%西曲溴銨，0.15%氯己定，阿苯達唑，10%聚維酮碘及95%乙醇等。它們雖然都可以起到殺死原頭節的作用，但都存在著很多缺點[5]，因此積極尋找術中抗棘球蚴的新藥成為肝包蟲術后防止復發研究中的一項重要課題。

塞來昔布(celecoxib)是高選擇性COX-2抑制劑[7]，目前被用于各領域的實驗及臨床的研究中，可以抑制多種腫瘤細胞的生長，促進凋亡[8]。以往人們對塞來昔布作用機制的認識僅限于其能夠抑制COX-2的活性，而起到抑制腫瘤細胞生長的作用，但隨著人們對其機制認識的不斷深入，發現塞來昔布等非甾體類藥可以在完全缺乏COX活性的細胞中發揮抑制生長的作用，說明這類藥物除抑制環氧合酶的途徑外，同時又有其他途徑的參與而發揮抑制細胞增殖的作用[9-11]。張 勇[12]等研究證實塞來昔布可通過抑制ERK2信號傳導通路而起到抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡的作用。

本研究觀察塞來昔布對體外培養細粒棘球蚴原頭節生長的影響。從實驗結果得知，50、100、150、200 μmol/L的塞來昔布作用原頭節后其生長均受到抑制。倒置顯微鏡下觀察各濃度塞來昔布作用后的原頭節活動度較DMSO和培養基組對比呈明顯下降趨勢，說明不同濃度的塞來昔布均對體外培養的細粒棘球蚴原頭節均有抑制生長和殺傷作用，并呈明顯濃度和時間依賴。

ERK2(細胞外信號調節激酶2)是MAPK信號通路中一條促進細胞生長及抗凋亡的通路，本課題組[13]研究發現ERK抑制劑PD98059體外有抑制原頭節生長的作用。本研究結果顯示塞來昔布能使細粒棘球蚴原頭節磷酸化ERK2表達減少，并有較明顯的濃度依賴性，表明塞來昔布能阻斷ERK2磷酸化，從而達到抑制細粒棘球蚴原頭節生長的作用，間接地表明塞來昔布抑制細粒棘球蚴原頭節生長作用與ERK2途徑有關，但是否同時有其他作用機制共同參與，值得進一步研究。

塞來昔布于2000年被美國食品藥品管理局首次批準用于家族性息肉病的治療，國內已有塞來昔布用于預防腫瘤的實驗研究報道[15]。本研究只是塞來昔布對細粒棘球蚴原頭節生長一個初步的探索，但塞來昔布抗細粒棘球蚴原頭節的作用機理還不明確，我們將在此基礎上進一步深入研究，為臨床開辟預防肝包蟲術后復發提供新途徑。

[1]Li HM, Lou ZZ, Li L.et al. Recombinant protein of Echinococcus granulosus EG95[J].Chin J Zoonoses, 2014,30(10):1066-1070.(in Chinese) 李宏民, 婁忠子, 李立, 等. 棘球蚴EG95重組蛋白研究進展[J].中國人獸共患病學報, 2014, 30(10):1066-1070.

[2]Adas G, Arikan S, Kemik O, et al. Use of albendazole sulfoxide, albendazole sulfone, and combined solutions as scolicidal agents on hydatid cysts (in vitro study)[J]. World Chin J Digestol, 2009, 15(1): 112-116.

[3]Peng XY , Zhang SJ, Niu JH , et al . A new principle of surgical procedures for hepatic hydatid disease -An analysis of 684 cases[J]. J Abom surg, 2003,16(1):19-21.(in Chinese) 彭心宇, 張示杰, 牛建華, 等. 肝包蟲病外科治療術式選擇的新觀點(附684例報道)[J].腹部外科,2003, 16(1):19-21.

[4]Rajabi MA.Fatal reactions and methacmoglobinaemia after silver nitrate irrigation of hydatid cyst[J].Surg Pract,,2009,13(5):2-7.

[5]Zeng XM, Guan YY, Wu WP. Epidemiological distribution characteristics of echinococcosis[J]. Chin J Zoonoses, 2014,30(4):413-417.(in Chinese) 曾祥嫚, 官亞宜, 伍衛平. 棘球蚴病的流行病學分布特征[J].中國人獸共患病學報, 2014,30(4): 413-417.

[6]Friedman DL, Whitton J, Leisenring W, et al. Subsequent Neoplasms in 5-Year Survivors of Childhood Cancer: The Childhood Cancer Survivor Study[J]. J Natl Cancer Inst, 2010, 102(14): 1083-1095.

[7]Chen J, Ran Y, Hong C, et al. Anti-cancer effects of Celecoxib on nasopharyngeal carcinoma HNE-1 cells expressing COX-2 oncoprotein[J]. Cytotechnology, 2010, 62(5): 431-438.

[8]Li QL, Ren MY. Research Progress in Antitumor Mechanism of Non-Steroidal Anti-Infl ammatory Drugs[J].Chin J Bases Clinics General Surg,, 2010, 62(5): 431-438.(in Chinese) 李權林, 任明揚. 非甾體類抗炎藥抗腫瘤機理的研究進展[J].中國普外基礎與臨床雜志,2012,19 (12):1368-1371.

[9]Harris RE, Alshafie GA, Abouissa H, et al. Chemoprevention of breast cancer in rats by celecoxib, a cyclooxygenase 2 inhibitor[J].Cancer Res, 2000, 60(8) :2101-2103.

[10]Honjo S, osaki M, Ardyanto TD, et al. COX-2 inhibitor, NS398, enhances Fas-mediated apoptosis via modulation of the PTEN-Akt pathway in human gastric carcinoma cell lines[J]. DNA Cell Biol,2005, 24(3):141-147.

[11]Baatar D, Jones MK, Pai R, et al.Selective cyclooxygenase-2 blocker delays healing of esophageal ulcers in rats and inhibits ulceration-triggered c-Met/hepatocyte growth factor receptor induction and extracellular signal-regulated kinase 2 activation[J]. Am J Pathol, 2002, 160(3):963-72.

[12]Zhang Y, Jiang MD, Zeng WZ, et al. Effects of celecoxib on cell proliferation and ERK2 expression of ERK2 in gastric cancer cells[J]. World Chin J Digestol, 2005, 13(18): 2213-2216.(in Chinese) 張勇, 蔣明德, 曾維政, 等. 塞來昔布對胃癌細胞生長及ERK2表達的影響[J].世界華人消化雜志,2005, 13(18): 2213-2216.

[13]Wang CH, Lü HL,Zhang J,et al. In vitro effects of the ERK inhibitor PD98059on Echinococcus granulosus protoscoleces[J]. J Pathog Biol, 2012, 7(07): 489-492.(in Chinese) 王成華, 呂海龍, 張晶, 等. ERK抑制劑PD98059體外抗細粒棘球絳蟲原頭蚴作用的研究[J]. 中國病原生物學雜志, 2012,7 (07): 489-492.

[14]Lan CH, Fang DC,Xiang DB, et al. Inhibition effects of celecoxib on the growth of gastric carcinoma in vitro and in vivo[J]. Chin J Gastroenterol Hepato, 2005;14(2):134-136.(in Chinese) 蘭春慧, 房殿春, 向德兵, 等. 環氧合酶-2抑制劑celecoxib抑制胃癌生長的實驗研究[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2005;14(2):134-136.

[15]Wang ZX, Shu YQ, Wang T, et al. Effects of cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib on cyclooxygenase-2 gene expression and cisplatin chemosensitivity in human lung adenocarcinoma A549 cell line[J]. Acta Universitatis Medicinalis Nanjing (Nat Sci) 2006,26(5): 337-342.(in Chinese) 王朝霞, 束永前, 王騰, 等. 塞來昔布對肺癌細胞的增殖抑制、環氧化酶-2表達的影響和化療敏感性[J]. 南京醫科大學學報:自然科學版, 2006,26(5): 337-342.

Lü Hai-long，Email：lvhl1999@126.com

Effects of celecoxib on viability and the expression of ERK2 inEchinococcusgranulosusprotoscoleces

WANG Bo1,JIANG Yu-feng2,LI Fang-fang1,WANG Zhuo1,XING Guo-qiang1, LEI Ying2,SHI Hong-juan2, ZHANG Shi-jie1,PENG Xin-yu2,LYU Hai-long1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832008，China)

The aim of this study was to explore the celecoxib in the viability ofEchinococcusgranulosusprotoscoleces, and to investigate the expression of extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2). Protoscoleces ofE.granulosuswere incubatedinvitrowith celecoxib at concentrations of DMSO, 50, 100, 150, 200 μmol/L，and the viability of protoscoleces was assessed on a daily basis by microscopic observation of movements, flame cell activity, and 0.1% eosin staining. P-ERK2 expression was determined by Western blot to evaluate the activation of ERK2. Control protoscolices incubated in the DMSO and RPMI 1640 medium were not altered and remained viable (95.5±0.5)% after 7 days of incubation. From day 1,the viability of protoscoleces started to decline due to the 150, 200 μmol/L of celecoxib. After 2 days,viable protoscoleces were no longer observed in cultures treated with 200 μmol/L of celecoxib but survival of (3.1±0.7)%.At 150μmol/L, celecoxib had a clearly decreased efficacy, with (43.9±0.4)% of protoscolices still viable after 3 days of treatment. Protoscolex death increased with time. Only a small fraction of protoscolices were viable in cultures treated with 100 μmol/L celecoxib after 7 days.Although 100mol/L, 50μmol/L of celecoxib had an effect on protoscoleces，the effect was not as pronounced as that of 200 μmol/L of celecoxib. Treatment with celecoxib down-regulated that of ERK2 protein inEchinococcusgranulosusprotoscolices. The date reported in this article demonstrate a clearly that celecoxib satisfactory action againstE.granulosusprotoscolecesinvitro,this effect may relate to the inhibition of ERK2 kinase signaling pathway.

celecoxib；Echinococcusgranulosus；protoscoleces； ERK2 signal pathway

國家自然科學基金資助項目(No. U1303121)資助

呂海龍，Email:lvhl1999@126.com

1.石河子大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科，石河子 832008; 2.石河子大學醫學院組織胚胎學教研室，石河子 832008

Supported by the National Natural Science Foundation of China( No. U1303121)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.013

R383.33

A

1002-2694(2015)06-0556-04

2015-01-15；

2015-03-14