補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響*

胡久略，郅 琳，卞 華，丁吉善，楊淑慧 (.河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474550； .南陽理工學院張仲景國醫學院，河南 南陽 473004 )

·實驗研究·

補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響*

胡久略1，郅 琳2，卞 華2，丁吉善2，楊淑慧2
(1.河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474550； 2.南陽理工學院張仲景國醫學院，河南 南陽 473004 )

目的：觀察補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響，探討其對血管性癡呆大鼠腦保護作用機制。方法：將Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、補腎醒腦方組、喜德鎮組4組，每組10只。均灌胃給藥，術前每天1次進行預防性給藥1周, 術后24 h繼續給藥，1 d 1次，連續7 d，模型對照組和假手術組給予蒸餾水(5 mL/d)灌胃，補腎醒腦方組給予補腎醒腦方灌胃，喜德鎮組給予喜德鎮灌胃。于術后的第2天、第4天、第6天測試各組大鼠的學習記憶能力；選取腦缺血再灌注24 h后為觀察點，采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠腦組織IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量，采用比色法測定ChAT、AchE活性。結果：補腎醒腦方治療組IL-1β、TNF-a和IL-10、TGF-β表達較模型對照組降低(P<0.05)，補腎醒腦方治療組AchE活性較模型對照組降低(P<0.05)，補腎醒腦方治療組ChAT的活性較模型對照組明顯提高(P<0.05)；補腎醒腦方治療組IL-1β、TNF-α表達較假手術組增高(P<0.05)；模型對照組IL-1β,TNF-α表達較假手術組顯著增高(P<0.01)；在控制其他因素不變的條件下，IL-1β與AchE呈正相關(r=0.94，P=0.000)，與ChAT呈負相關(r=-0.93，P=0.002)；TNF-a與AchE呈正相關(r=0.92，P=0.003)，與ChAT呈負相關(r=-0.91，P=0.004)。結論：促炎因子TNF-a、IL-1β和抗炎因子TGF-β、IL-10在缺血性腦損傷中具有重要作用，Ach可抑制致炎細胞因子釋放。補腎醒腦方可作用于膽堿能抗炎通路，能夠緩解血管性癡呆大鼠迷走神經受到的阻抑作用，使Ach的合成增加，抑制炎性反應，減輕腦組織的損傷。

血管性癡呆；補腎醒腦方；膽堿能抗炎通路；腫瘤壞死因子a；白介素-1β；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉移酶；動物；大鼠

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是老年人的常見病和多發病，是老年期癡呆的主要類型之一。中醫藥對血管性癡呆具有較好的療效優勢。補腎醒腦方是臨床治療VD的有效方劑，具有化痰祛瘀、補腎益氣、醒腦開竅之效。前期研究發現本方對VD 療效肯定，能提高VD大鼠的學習記憶能力，改善腦組織的病理形態，其機制與改變氨基酸類神經遞質的含量、抑制細胞的凋亡、改善自由基的代謝等有關[1-7]。本研究采用比色法檢測腦組織AchE、ChAT的活性，研究VD大鼠腦組織AchE和ChAT的變化及其與TNF-a、IL-1β和IL-10、TGF-β相關性，探討該方對VD大鼠膽堿能抗炎通路(CAP)的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

成年雄性4月齡Wistar大鼠40只，普通級，體質量190～250 g，購自鄭州大學實驗動物中心，合格證號：醫動字第20-012號。

1.2 藥品、試劑與儀器

補腎醒腦方組成：熟地黃12 g，制首烏12 g，女貞子12 g，人參9 g，丹參9 g，川芎9 g，赤芍9 g，石菖蒲6 g，遠志6 g，天麻6 g等。藥品購入后經南陽理工學院中藥教研室鑒定。制備方法：藥物以總體積的5倍量水冷浸3 h，微沸1 h×2次，合并濾液，文火濃縮成質量分數為3 g/mL的濃縮液，無菌條件下裝瓶，放置4 ℃冰箱備用。喜得鎮(批號140311),天津華津制藥廠產品，用生理鹽水配制成0.03 g/L的藥液備用。 AchE試劑盒(批號20131221)、ChAT試劑盒(批號20130605)、考馬斯亮蘭蛋白試劑盒(批號20130730)，均由深圳晶賽生物技術有限公司提供。722型可見光分光光度計，上海菁華科技公司產品；400R低溫離心機，北京昊諾斯科技公司產品；高速冷凍離心機，上海強智生物科技公司產品；DY89-1電動玻璃勻漿機，上海新諾儀器設備公司產品；Multiskan MK3型酶標儀，上海甘薇生物科技公司產品；低溫冰箱，南京伯樂公司產品；顯微照相機，深圳市海量光電公司產品；輪轉式切片機，上海之信儀器公司產品；光學生物顯微鏡，上海長方儀器廠產品。

1.3 動物的篩選

大鼠適應性喂養1周后，采用穿梭箱主動回避反應系統訓練篩選。此系統用燈光作為刺激，足底電擊作為非條件刺激。若大鼠在燈光刺激情況下即可完成穿梭動作稱之為主動回避反應(AAR)，而經電刺激后方能夠完成穿梭動作稱之為被動回避反應(PAR)。大鼠的記憶學習能力以能夠完成主動回避反應(AAR)次數與測試總次數(20次)的比值，即被動回避反應(PAR)習得率來表示。大鼠在模型制作前皆要經過穿梭箱訓練7 d，AAR習得率大于/等于80%者方能入選。

1.4 VD模型的建立

采用高脂飲食法[8]以及貓嚇鼠法[9]制作腎虛痰瘀模型[10]：將大鼠籠放在貓籠下面，中間用一層鐵絲網隔開，貓有時候可以接觸到大鼠。同時反復播放兇狠的貓叫聲音錄音磁帶。于每天上午9：00-11：00、下午15：00-17：00恐嚇大鼠，共計1個月。同時喂食大鼠高脂飼料20 g(0.5%膽酸鈉，81.3%普通飼料，0.2%丙基巰氧嘧啶，10%豬油， 3%膽固醇， 5%白糖)，火腿腸14 g，連續喂養1個月。

腎虛痰瘀模型成功后，制作VD大鼠模型[11-13]：灌胃到第30天，在給藥1 h后，大鼠用100 g/L 的水合氯醛腹腔注射(350 μg/g)麻醉，仰臥固定在手術臺之上，常規消毒后，頸正中部切口，快速分離雙側的頸總動脈，穿線以備用。同時以 3.5 μg/g的劑量經腹腔注射硝普鈉用以造成低血壓，然后使用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，再通10 min，如此反復操作3次，再通后縫合大鼠傷口，放回到籠中繼續飼養。第2天繼續灌胃。假手術組僅分離頸總動脈，不注射硝普鈉，亦無雙側頸總動脈反復夾閉。術后立即注射青霉素16 U/g預防感染。

模型成功標準：缺血再灌注術后2～6 h內觀察大鼠的功能及軀體感覺，按照5分制神經病學評分標準[14]實施評分。0分：無神經方面的損傷癥狀。1分：不能完全伸展開對側的前爪與后爪。2分：能向手術對側進行轉圈。3分：能向手術對側進行傾倒。4分：喪失意識，不能進行自發行走。1分及1分 以上者視為模型成功，少于1分者視為未成功。未成功者棄去。

1.5 動物分組與給藥

將篩選合格的40只Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、補腎醒腦方組、喜德鎮組4組，每組10只，每籠5只。大鼠自由覓食飲水，在室溫22 ℃～25 ℃、濕度45%左右環境下喂養。各組均灌胃給藥，術前每天1次進行預防性給藥1周, 術后24 h繼續給藥。模型對照組和假手術組給予蒸餾水灌胃， 5 mL/d；補腎醒腦方組給予補腎醒腦方灌胃；喜德鎮組給予喜德鎮灌胃。給藥劑量均按照體質量進行換算[15]，1 d 1次，連續7 d。

1.6 檢測指標

1.6.1 學習記憶能力測試

使用穿梭箱主動回避反應系統，每一組大鼠于術后的第2天、第4天、第6天進行測試。

1.6.2 腦組織ChAT、AchE活性

采用比色法進行ChAT、AchE活性測定。取大鼠海馬組織的上清液，加入到反應體系之中檢測酶的活性。空白管、標準管、測定管分別加入試劑，然后混合均勻，以3 500 r/min離心10 min，取其上清液，于520 nm和1 cm光徑進行比色，空白管調為零，檢測各管的吸光度，根據顏色的深淺以比色定量。

1.6.3 大鼠腦組織IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量

采用酶聯免疫吸附法檢測。于造模成功后第7天將大鼠斷頭，取左側大腦的半球，在冰臺上快速去掉小腦、腦干和嗅腦，用冰生理鹽水沖洗干凈，吸干后稱取腦組織質量并放置于-20 ℃冰箱內保存。將待測的組織樣品從低溫冰箱內取出至室溫復蘇，按組織樣品與生理鹽水9∶1的比例，制備成質量分數為100 g/L的腦組織勻漿，2 200 r/min離心10 min，取上清腦組織勻漿以備待測。將試劑盒在室溫下放置40 min，試劑在使用前輕輕地搖均勻；新鮮的雙蒸水和濃縮洗滌液皆1∶20倍稀釋，混合均勻后于室溫下放置備用。按照試劑盒提供的方法進行檢測。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0統計分析軟件處理。數據以均數(x)±標準差(s)表示。每組數據先進行方差齊性檢驗和正態分布，多組間的差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，多組間兩兩之間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠穿梭箱AAR習得率成績對比

模型對照組大鼠第2天AAR習得率明顯低于對照組；第4天、第6天時進一步降低，與假手術組對比，差別均有統計學意義均(P<0.01)。中藥治療組各時間點AAR習得率較模型對照組同時間點顯著增高，差別有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠穿梭箱AAR習得率成績對比n=10，x±s

注：與假手術組對比，*P

2.2 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活力對比

腦缺血再灌注24 h后,模型對照組大鼠海馬組織AchE活性稍有升高，提示血管性癡呆模型造成了乙酰膽堿代謝異常；兩給藥組皆能顯著抑制血管性癡呆大鼠AchE活性 (P<0.05),但兩組之間對比，差別無統計學意義(P>0.05)。大鼠腦缺血再灌注24 h后,模型對照組大鼠ChAT的活性顯著降低(P<0.01)；兩給藥組皆能顯著改善血管性癡呆大鼠ChAT的活性，但兩組對比差別無統計學意義(P>0.05)。此提示藥物能夠促進乙酰膽堿在腦內的合成代謝；見表2。

表2 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活力對比 U·mg-1，x±s

注:與假手術組對比，*P<0.05,**P<0.01；與模型對照組對比, #P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β含量的影響

腦缺血再灌注7 d后，模型對照組大鼠腦組織中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的含量均明顯增高(P<0.01)。兩治療組均能夠不同程度地降低促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的含量，對VD大鼠的炎性反應具有顯著的抑制作用，但兩組間對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量對比 ng·gpr-1，x±s

注：與假手術組對比，*P<0.05, **P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05#,##P<0.01。

腦缺血再灌注7 d后，模型對照組大鼠腦組織抗炎細胞因子TGF-β、IL-10的含量皆有一定程度地增高。兩治療組均可不同程度地降低抗炎細胞因子TGF-β、IL-10的含量，但兩組間對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織IL-10、TGF-β含量對比 ng·gpr-1，x±s

注：與假手術組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.4 ChAT及AchE與IL-1β及TNF-α相關性分析

在控制其他因素不變化的條件下，IL-1β與AchE呈正相關(r=0.94，P=0.000)，與ChAT呈負相關(r=-0.94，P=0.003)；TNF-a與AchE呈正相關(r=0.92，P=0.003)，與ChAT呈負相關(r=-0.91，P=0.004)。見表5。

表5 ChAT及AchE與IL-1β及TNF-α相關性分析

3 討 論

炎性反應產生的炎性細胞因子可以通過無血腦屏障的室周器官進入腦，或由孤束核、迷走背核感受后上行進入中樞。研究表明：神經系統能夠通過迷走神經快速、顯著地抑制巨噬細胞釋放促炎細胞因子，減輕炎性反應的發生，這一作用機制稱之為“膽堿能抗炎通路”[16]，是一種神經—免疫調節通路，可以高效地反饋調節、監測炎性反應，通過釋放Ach，抑制促炎因子的釋放，具有直接、快速、整合、局限、早期調節炎性反應的特點[17-19]。膽堿能抗炎通路的激活可以有效減少諸種促炎細胞因子的釋放，對局部和全身的炎性反應均有顯著的阻抑作用。

細胞因子是腦缺血/再灌注炎性反應中非常重要的炎性免疫因子。根據在炎性反應中的作用將其分為抗炎因子(IL-1ra、TGF-β、IL-6 、IL-10等)和促炎因子(IL-1β、IL-8 、TNF-α等)兩大類。研究表明：在腦缺血/再灌注應激狀況下，炎性細胞因子會率先誘導產生，其中主要是促炎因子IL-1β和TNF-α，然后會引發局灶性的內皮細胞、星形膠質細胞血管周圍細胞與神經元發生炎性反應，并會刺激其他細胞因子和炎性介質的產生，誘導損傷區白細胞浸潤，以及小膠質細胞的激活。細胞因子能刺激白細胞與內皮細胞的粘附、細胞粘附分子的產生，最終能夠使內皮細胞轉化為血栓前或炎癥前的狀態，白細胞則向炎癥性病灶區域聚集；炎性免疫細胞與細胞因子亦可相互激活，通過錯綜的“細胞因子網絡”系統調節諸多細胞的功能，產生過量的炎性反應，如此不僅可以影響及局部的血液供應，而且可直接破壞細胞組織的結構，進一步加重缺血區的腦組織的損傷[20]。

腦缺血再灌注常伴有炎性反應，在炎性細胞反應發生之前有介導炎性反應的細胞因子的表達。IL-1β、TNF-α是腦缺血性/再灌注損傷所誘發的起始調節因子，可以引發諸多反應通路，在缺血/再灌注腦損傷過程中具有非常重要的作用； IL-10、TGF-β作為抗炎因子在腦缺血/再灌注損傷中亦具有重要作用。

目前已知，AchE為Ach之水解酶，ChAT為Ach之合成酶，其血清或腦組織含量能夠反映Ach的含量。本研究結果發現：與假手術組對比，模型對照組腦組織中IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10和AchE均顯著升高，腦組織中ChAT明顯降低；其相關性分析則提示IL-1β與ChAT呈負相關，與AchE和TNF-α與呈正相關。此則表明VD發生后Ach的合成明顯減少，迷走神經被抑制，炎性反應進一步加重。

補腎醒腦方由地黃飲子加減化裁而來，具有化痰祛瘀、補腎益氣、醒腦開竅之功。該實驗結果發現：補腎醒腦方組腦組織AchE較模型對照組低，ChAT較模型對照組高，TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β較模型對照組低，提示該方作用于迷走神經—膽堿能抗炎通路，對血管性癡呆大鼠迷走神經起到了抑制作用，使Ach的合成增加，減輕了炎性反應，從而能夠減少缺血/再灌注后腦組織的損傷。

綜上所述， 膽堿能抗炎通路在VD模型大鼠的生理病理中有著非常重要作用。補腎醒腦方可以通過調節其功能，顯著減輕炎性反應，抑制腦組織的損傷，但其深入的作用機制仍待進一步研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0066-05

R749.1+3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.31

胡久略(1977-)，男(漢族)，河南信陽人，副教授，中醫學博士，河南省宛西制藥股份有限公司在站博士后，在南陽理工學院張仲景國醫學院主要從事方劑學教學與臨床工作，主要研究方向：方劑配伍規律、療效機理及中醫藥防治腦病的研究。

河南省科技廳科技公關計劃項目(152102310224)

2015-06-12;

2015-10-08