黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎細胞DNA和組織結構的影響*

耿廣琴，李能蓮,劉 卉，楊雅麗，黃 勇 (.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000； .甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎細胞DNA和組織結構的影響*

耿廣琴1，李能蓮1,劉 卉2，楊雅麗1，黃 勇1
(1.甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科，甘肅 蘭州 730000)

目的: 研究黨參水提物對衰老模型小鼠肝、腎DNA和肝、腎組織結構的影響，探討黨參保肝、護腎、抗衰老的機制，為中醫藥延緩衰老提供科學依據。方法: 將100只小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組。模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質量分數50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g；正常對照組注射同體積量生理鹽水。3個黨參治療各組每日上午按相當于生藥量5，10，15 g/kg 3個劑量給致衰老小鼠灌服黨參水煎液，與造模同步，連續服藥42 d。采用單細胞凝膠電泳檢測肝、腎細胞DNA損傷，石蠟切片法觀察肝、腎組織結構變化。結果：給予10,15 g/kg黨參水提物后，小鼠肝腎細胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩明顯降低，差別有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。模型對照組肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，胞漿疏松化，細胞變性，炎細胞浸潤明顯；腎小球萎縮，腎小管上皮細胞腫脹、變性或壞死，灶狀小管萎縮，腎間質呈現明顯的纖維化病變。給予黨參水提物后，高劑量組肝細胞變性明顯改善，炎性浸潤顯著減輕；腎小球萎縮明顯緩解，腎小管上皮細胞腫脹、變性減輕，腎間質纖維化病變也明顯緩解。結論: 黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能是通過減輕肝、腎細胞DNA損傷，減緩衰老致肝、腎組織結構退行性病變，達到延緩衰老的作用，而更深入的機制探討尚需進一步研究。

黨參水提物/藥效學；衰老/藥物作用；D-半乳糖致衰老模型；DNA損傷；組織結構變化；動物；小鼠

衰老是生命過程中的一個必然階段。雖然導致和影響衰老的因素很多，但是，五臟是生命活動的中心，五臟生理功能正常則生命活動就正常，從而維持機體健康與長壽；反之，如果五臟虛損，生理功能失常，生命活動就失常，進而影響健康與壽命；因此，衰老是五臟虛損共同作用的結果[1]。肝主疏泄，調節氣機，是保持機體氣機正常升降出入的重要臟腑[2]。腎為先天之本，腎主藏精，對機體的生長、發育和衰老起著決定性的作用[3]。由此可見，在五臟之中，肝腎虛損與衰老的關系極為密切，故研究肝臟、腎臟衰老的機制和延緩肝、腎二臟衰老具有重要意義。本實驗利用D-半乳糖致衰老模型小鼠為對象，研究黨參水提物對衰老模型小鼠肝、腎DNA及肝、腎組織結構的影響，探討中藥黨參保肝護腎抗衰老的機制，為中醫藥延緩衰老提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級2月齡昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質量(18±2) g，購自甘肅中醫學院科研實驗動物中心，合格證號: SCXK(甘) 2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

黨參，采自甘肅岷縣，經甘肅中醫藥大學中藥學教研室鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并兩次提取液，過濾后濃縮成質量分數為0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱備用，水煎液每 5天制備1次。D-半乳糖，美國Sigma公司產品，批號063K0044，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用；正常熔點的瓊脂糖(批號090M01452A)、低熔點的瓊脂糖(批號090M01549V)，均為美國Sigma公司產品；臺盼蘭、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙錠(EB)等，均為國產分析純。BS224S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司產品；HH-4數顯恒溫水浴鍋，鄭州杜甫儀器廠產品；XYJ80-20型離心機，金壇市恒豐儀器廠產品；XW-80A型旋渦混勻器，上海精科實業有限公司產品；DYY-Ⅲ型電泳儀，北京六一廠產品；CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司出品；CX31-12C04光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司出品。

1.3 動物分組與模型的建立

將100只小鼠隨機分為正常對照組，模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組5組，每組20只，雌雄各半。模型對照組和黨參水提物低、中、高劑量組每日每只小鼠頸背部皮下注射質量分數50 g/L的D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g，正常對照組注射等體積生理鹽水。黨參治療各組每日上午按相當于生藥量5，10，15 g/kg 3個劑量給致衰老小鼠灌服黨參水煎液，與造模同步，連續服藥42 d。

1.4 檢測指標

于末次給藥2 h后，稱量各組小鼠體質量，斷頭處死小鼠，迅速剖取肝、腎，用預冷的4 ℃生理鹽水洗凈表面殘血備用。

1.4.1 DNA損傷

采用單細胞凝膠電泳檢測。用37 ℃的PBS緩沖液沖洗肝、腎組織，分別勻漿，加適量PBS懸浮細胞，收集細胞懸液于1.5 mL的ephendorf管中，靜置下沉3 min，將上部懸液轉至另一個ephendorf管中，800 r/min離心5 min，棄上清，用PBS將細胞濃度調整至104～105個/mL。臺盼蘭檢測細胞活率，大于90%方可進行實驗。單細胞凝膠電泳按照Singh[4]描述的方法稍加改進，將5 g/L的正常熔點的瓊脂糖液100 μL鋪展到有磨痕的載玻片上，自然風干，作為第1層膠；取正常熔點7 g/L瓊脂糖100 μL，鋪第2層膠；去掉蓋玻片后加入制備的細胞懸液(細胞懸液體積∶5 g/L的低熔點瓊脂糖溶液體積=1∶8)100 μL鋪展到載玻片上作為第3層。將載玻片浸入新配置的4 ℃預冷裂解液，裂解2 h，電泳液中解旋30 min，25V，300 mA電泳30 min。電泳完畢后用48.4 g/L Tris-HCl緩沖液中和，EB染色，熒光顯微鏡下觀察，拍照。選擇尾長、尾矩和Olive尾矩作為DNA損傷指標。尾長即沿電泳方向“彗星”尾部最遠端與頭部中心之間的距離， 尾矩即尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部光強度重心間距的乘積， Olive尾矩即從頭部光密度重心到尾部光密度重心的距離與尾部DNA含量的乘積。

1.4.2 肝、腎組織結構

采用石蠟切片法。肝、腎臟組織用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片(厚度7μm)，HE染色，光鏡下觀察，拍照，MiE顯微圖像分析軟件進行分析。單細胞凝膠電泳結果采用Kinetic Imaging Comet 4.0軟件進行分析，選定目標圖像后由軟件自動測量并輸出尾長、尾矩和Olive尾矩數據，每個樣本隨機測量100個細胞。

1.5 統計學方法數據

采用SPSS 13.0統計分析軟件處理。數據以均數(x)±標準差(s)表示，組間差異采用one-way ANOVA分析。以P<0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠肝、腎的DNA損傷

模型對照組小鼠肝、腎細胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩較正常對照組均明顯增加(P<0.01)。給予10，15 g/kg黨參水提物后，小鼠肝腎細胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩明顯降低，差別有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；與正常對照組對比，黨參水提物低、中、高各劑量組小鼠肝、腎細胞DNA尾長、尾矩、Olive尾矩仍呈現明顯的增高趨勢(P<0.01或P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肝、腎細胞DNA損傷對比n=20，x±s

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01； 與正常對照組對比， #P<0.05，##P<0.01。

2.2 小鼠肝、腎組織結構變化

正常對照組小鼠肝細胞為典型多邊形腺上皮細胞，以中央靜脈為中心，向四周呈放射排列，肝細胞邊界清晰，細胞形態完整、整齊，細胞核圓形位于細胞中央，核膜清楚，核仁也清晰可見。模型對照組肝細胞排列紊亂，細胞腫脹，胞漿疏松化，細胞脂肪變性清晰可見,炎細胞浸潤明顯。黨參低劑量組肝細胞形態依然不齊，細胞脂肪變性、炎性浸潤明顯。黨參中劑量組中央靜脈周圍部分細胞結構恢復正常，但距離中央靜脈略遠處細胞脂肪變性仍較明顯。黨參高劑量組肝細胞變性明顯改善，炎性浸潤顯著減輕,細胞邊界較為清晰,形態較完整，細胞排列也較為整齊。見圖1。

正常對照組

模型對照組

黨參水提物低劑量組

黨參水提物中劑量組

黨參水提物高劑量組

正常對照組小鼠腎小球呈圓形，外周規整，腎小囊的囊腔正常，腎小管的管腔規整。模型對照組小鼠腎小球不規整，可見部分萎縮的腎小球，腎小管上皮細胞腫脹、變性或壞死，灶狀小管萎縮，腎間質呈現明顯的纖維化病變。黨參水提物各組腎組織異常變化有所改善，其中高劑量組腎小球萎縮明顯緩解，腎小管上皮細胞腫脹、變性有所緩解，腎間質纖維化病變也明顯緩解。見圖2。

正常對照組

模型對照組

黨參水提物低劑量組

黨參水提物中劑量組

黨參水提物高劑量組

3 討 論

DNA是生命遺傳的物質基礎，也是生命信息的載體，它的穩定對于生命體的正常繁殖和生長至關緊要。研究表明，隨年齡增長，機體內DNA損傷程度明顯增加[5-7]，而DNA損傷修復能力明顯下降[8-10]。當DNA損傷累積到一定程度后可導致轉錄失調，從而引起生物體適應性降低并最終表現為衰老[11]。

本研究中的單細胞凝膠電泳結果顯示：模型對照組小鼠肝、腎細胞DNA損傷程度明顯增加。給予黨參水提物后，小鼠肝、腎細胞DNA損傷減輕，高劑量組減輕尤為顯著。此說明高劑量黨參水提物可通過減緩肝、腎細胞DNA損傷的方式而起到延緩衰老的作用；但與正常對照組對比，黨參水提物各劑量組肝、腎細胞DNA還是處于較高的損傷狀態，說明黨參只能在一定程度上減輕肝、腎細胞DNA的損傷，并不能完全扭轉衰老致DNA損傷的積累。

病理切片觀察顯示：模型對照組肝細胞腫脹，胞漿疏松化，細胞出現明顯變性、壞死；部分腎小球萎縮，腎間質呈現明顯的纖維化病變。肝、腎臟是人體的重要器官，其結構的異常改變必然導致肝、腎組織功能的下降。給予黨參水提物后，肝細胞變性改善，炎性浸潤減輕，腎小球萎縮緩解，腎小管上皮細胞腫脹、變性減輕，揭示黨參水提物對衰老致肝、腎組織結構損傷有一定的修復作用。

本實驗結果表明：黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、腎損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能是通過減輕肝、腎細胞DNA的損傷，減緩衰老致肝、腎組織結構退行性病變，達到延緩衰老的作用，而更深入的機制探討尚需進一步研究。

[1]周安方,郭煜暉,舒勁松.腎脾虛損導致衰老的機理探析[J].湖北中醫雜志，2011,33(8):23-24.

[2]王玉芳.肝調節氣機是補腎健脾抗衰老的前提[J].中醫藥信息， 2012,29(1): 8-9.

[3]楊婧,杜萬紅.淺談中醫學對衰老的認識[J].中醫藥導報， 2010,16(8): 129-131.

[4]Singh NP,McCoy MT,Tice RR,et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Exp Cell Res，1988,175(1): 184-191.

[5]Chevanne M,Caldini R,Tombaccini D,et al.Comparative levels of DNA breaks and sensitivity to oxidative stress in aged and senescent human fibroblasts: a distinctive pattern for centenarians[J].Biogerontology，2003,4(2): 97-104.

[6]Sedelnikova OA,Horikawa I,Zimonjic DB,et al.Senescing human cells and ageing mice accumulate DNA lesions with unrepairable double-strand breaks[J].Nat Cell Biol,2004,6(2):168-170.

[7]Hamilton ML,Van Remmen H,Drake JA ，et al.Does oxidative damage to DNA increase with age[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10469-10474.

[8]Waldstein EA,Peller S,Setlow RB.UV-endonuclease from calf thymus with specificity toward pyrimidine dimers in DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(8):3746-3750.

[9]Nette EG,Xi YP,Sun YK,et al.A correlation between aging and DNA repair in human epidermal cells[J].Mech Ageing Dev,1984,24(3):283-292.

[10]韓宗超,張蘇明,方思羽，等.彗星實驗檢測氧化介導的大鼠神經細胞DNA損傷與修復[J].中華老年醫學雜志,2000,19(2):115-118.

[11]Bahar R,Hartmann CH,Rodriguez KA，et al.Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart[J].Nature,2006,441(7096):1011-1014.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0063-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.30

耿廣琴(1971-)，女，甘肅蘭州人， 講師，碩士，主要從事生物化學的教學及研究。

楊雅莉，講師，yali5642@sina.com

甘肅省教育廳科研項目 (2013A-087)

2015-02-08；

2015-09-10