冠心病患者中Th17細胞水平的變化及其意義探討

摘要：目的 探討不同類型冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者外周血輔助性T細胞17（T help cell 17，Th17細胞）的變化及其臨床意義。方法 選取急性心肌梗死（AMI）患者20例、不穩定性心絞痛（UA）患者25例、穩定性心絞痛（SA）患者19例及健康體檢者22例。采用流式細胞儀檢測各組患者外周血Th17細胞占CD4+T細胞比例，采用實時定量PCR方法檢測IL-17mRNA的表達，采用酶聯免疫吸附方法（ ELISA）檢測各組患者外周血白細胞介素（IL）-17的表達。結果 AMI組和UA組患者外周血Th17細胞/CD4+T細胞、IL-17mRNA、IL-17表達明顯高于SA組和健康對照組（P<0.001）；SA組和健康對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。結論 AMI患者和UA患者外周血中Th17細胞比例增加， IL-17mRNA及IL-17水平升高， Th17 細胞可能參與動脈粥樣斑塊不穩定和冠心病的發病。

關鍵詞：冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；輔助性T細胞17；IL-17；IL-17mRNA

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，基本病因是冠狀動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈血管壁的慢性炎癥反應，其中CD4+T淋巴細胞發揮著重要的作用[1]。近年來發現一種新的CD4+T淋巴細胞即Th17細胞，能分泌白介素（Interleukin）-17等多種細胞因子參與炎癥過程[2]。許多研究表明Th17細胞及其分泌的細胞因子參與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等多種疾病發病及進展[3-4]。而目前動物實驗表明， 在動脈粥樣斑塊的發生發展中， IL-17參與巨噬細胞的活化并通過相關機制釋放蛋白水解因子，IL-17和TNF-α水平的增加能夠發揮協同作用創造促炎微環境， 從而促進動脈粥樣硬化性疾病的發生發展。由此我們推測 Th17細胞可能通過IL-17的促炎效應，參與并促進粥樣斑塊不穩定和急性冠狀動脈綜合征（ACS）的發生發展。本研究通過檢測不同類型的冠心病患者外周血Th17細胞、細胞因子IL-17及IL-17mRNA表達水平，分別從細胞水平、分子水平及基因水平進一步探討Th17細胞在冠心病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2008年10月～2012年10月我院確診急性心肌梗死（AMI）患者20例，男17例，女3例，年齡（56.8±6.4）歲；不穩定型心絞痛（UA）患者25例，男20例，女5例，年齡（52.9±5.9）歲；穩定型心絞痛（SA）患者19例，男15例，女4例，年齡（55.6±7.2）歲。所有患者均行冠狀動脈造影檢查。對照組為同期經冠脈造影及臨床癥狀排除冠心病的住院患者22例，男19例，女3例，年齡（53.5±6.8）。排除標準：6個月以內的心肌梗死患者，并發腦卒中、嚴重的肝腎功能不全者，周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病患者，惡性腫瘤患者，自身免疫性疾病、血液系統疾病及服用免疫抑制劑患者。

1.2方法

1.2.1標本收集 所有受試者及正常對照組在清晨空腹抽取外周靜脈血5ml置于肝素抗凝管中，標本室溫狀態下1000轉離心15min，收集上清。分裝后-80℃冷凍保存備用。

1.2.2人外周血單個核細胞分離及Th17細胞檢測 清晨空腹采肘靜脈血5ml，肝素鈉抗凝， 用PBS等量稀釋后采用人淋巴細胞分離液密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞（PBMC）。用RPMI MEDIUM 1640完全培養液調整細胞濃度為1×106個/ml。取出2×106個細胞，分別加入24孔無菌培養板的2個孔內，每孔1×106個細胞，用RPMI MEDIUM 1640完全培養液定容至1L，每孔各加入2μl PMA（30ng/ml）和10μl Iono（750μg/ml），槍頭攪拌混勻，放入37℃ 5%CO2培養箱孵育1h，每孔再各加入1μl高爾基體阻斷劑；放入37℃ 5%CO2培養箱孵育4～6h；收集細胞平均分為測定管和同型對照管。加入APC標記的CD4（ebioscience公司）3μl，放入4°冰箱30min。FACS液體2ml洗兩遍。加入FIXATION/Permeabilization商品盒（BD公司）250μl，放入4°冰箱30min。加入Permeabilization Buffer液體1ml，1500轉/min，8min，離心倒去上清液，洗2遍。分別加入PE標記的IL-17（ebioSCIENCE公司）和同型對照抗體10μl，放入4°冰箱30min。再用Buffer液洗3遍。倒去上清液后加入含1%的PFA固定。流式細胞儀測定Th17細胞比例。

1.2.3實時定量PCR檢測IL-17mRNA的表達 如前收集細胞1×106個，采用Trizaol試劑裂解PBMC提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。IL-17熒光定量PCR引物用Primer 5軟件設計，并由上海生物工程有限公司合成。IL-17上游為：TCTCCAAAGGAAGCCTGA，下游為：CAAGACTGAACACCGACTAAG，擴增片段231bp。β-actin上游為：CACGAAACTACCTTCAACTCC，下游為：CATACTCCTGCTTGCTGATC，擴增片段378bp，以cDNA作為模板在熒光定量PCR儀上測定。準備反應液，反應條件為：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s， 35個循環。擴增循環結束后 進行融解曲線分析。

1.2.4 ELISA法檢測血清IL-17的濃度 應用ELISA 試劑盒進行檢測， 按照說明書進行操作，在波長為450nm下用酶標儀測定OD值。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，所有資料均采用（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組患者臨床資料的比較 各組患者在年齡、性別和冠心病危險因素方面的差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2各組冠心病患者及正常對照組外周血Th17細胞數量比較 AMI組和UA組患者外周血Th17細胞/CD4+T細胞分別為（2.49±0.08）%， （2.43±0.07）%，兩組間差異無統計學意義（P>0.05）；AMI組和UA組患者外周血Th17細胞/CD4+T細胞均明顯高于SA組（1.37±0.16）%和正常對照組（1.30±0.09）%， 差異有統計學意義（P<0.05）；而SA組和正常對照組之間差異無統計學意義。

2.3各組冠心病患者及正常對照組外周血血漿IL-17水平比較 AMI組和UA組患者外周血IL-17水平分別為（37.53±9.28）ng/L，（34.11±5.56）ng/L，均明顯高于SA組（26.59±5.09）ng/L和正常對照組（22.81±3.42）ng/L， 差異有統計學意義（P<0.05）；而SA組和正常對照組之間差異無統計學意義。

2.4各組冠心病患者及正常對照組外周血IL-17mRNA水平比較 AMI組和UA組患者外周血IL-17mRNA水平均明顯高于SA組和正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

急性冠狀動脈綜合征是由于冠狀動脈內存在不穩定的粥樣斑塊，在一定誘因的影響下，斑塊破裂引起冠狀動脈的狹窄加重、血栓形成，甚至完全閉塞，造成患者的心肌缺血、壞死，臨床類型包括不穩定性心絞痛和急性心肌梗死。在不穩定斑塊的破潰中， 免疫細胞和炎癥因子參與了AS的發生和發展，其中T淋巴細胞起著至關重要的作用[5-6]。目前研究表明冠心病患者體內存在T淋巴細胞亞群失衡， 主要表現為Th1細胞功能亢進[7]。而近年來發現一種新的CD4+T細胞亞型，即Th17細胞，它主要分泌IL-17、IL-21、IL-22等細胞因子[2]，在多種自身免疫疾病如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡的發病中起著關鍵作用。但有關Thl7細胞是否參與ACS發病機制的研究較少且結論不完全一致。多數研究表明IL -17促進AS的發生[8]，但亦有研究表明IL-17可能對AS起保護作用[9]。

為進一步明確Thl7細胞與ACS發生發展的關系，本試驗分別從細胞水平、分子水平和基因水平來探討Th17細胞在ACS發病中可能的作用機制。本研究中首先采用流式細胞術檢測了AMI組、UA組、SA組及正常對照組受試者外周血中Thl7細胞表達占CD4+T細胞的比例，研究結果顯示AMI組和UA組受試者外周血中Thl7細胞比例顯著高于SA組和正常對照組；其次采用實時定量PCR技術檢測4組受試者PBMC中Th17 mRNA表達水平， 結果顯示， IL-17 mRNA表達在AMI組和UA組中明顯升高；最后，采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組受試者外周血血漿IL-17的表達，結果顯示IL-17在AMI和UA組中表達顯著高于SA組和正常對照組。這提示AMI和UA患者體內存在Th17細胞激活，它參與了全身或局部炎癥反應加劇，促進斑塊的不穩定破潰，是ACS可能發病機制之一。我們知道，IL-17通過誘導粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和IL-8分泌參與中性粒細胞募集反應，可以促進單核細胞分泌炎癥因子TNF-α和IL-1β， 并與其發揮協同作用， 進一步加強炎癥反應。此外，IL-17能促進內皮細胞生產大量血管性假血友病因子（von Willebrand Factor， VWF），并通過激活線粒體途徑誘導內皮細胞調亡，導致內皮損傷或功能異常，創造促炎微環境從而促進AS的發生發展[10]。

Th17細胞的分泌異常參與了Th細胞亞群紊亂失衡，從而參與疾病發生發展，我們尚需進一步研究探討Th17細胞與其他細胞及炎癥因子的相互關系，進一步闡明ACS可能發病機制，從而為急性冠狀動脈綜合征炎癥干預提供新的治療新靶點，為患者帶來福音。

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