鹿壽春堂鹿骨鈣促進骨細胞增殖及其毒理穩定性研究

摘要：目的 觀察鹿骨鈣對骨細胞增殖的促進作用并對其毒理穩定性進行初步評價。方法 采用DMEM（10%FBS）培養液體外培養大鼠成骨細胞，MTT法檢測不同濃度鹿骨鈣溶液對鼠成骨細胞的增殖作用；選取健康小鼠20只，雌雄各半，分為實驗組和對照組，對實驗組小鼠進行急性毒性試驗。結果 鹿骨鈣片作用于鼠成骨細胞72h后，在一定濃度范圍內，OD值明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），可促進骨細胞增殖；實驗組小鼠口服鈣片的LD50值大于8500mg/kg。結論 鹿壽春堂鹿骨鈣是一種能夠促進骨細胞增殖的無毒級物質。

關鍵詞：鹿春堂鹿骨鈣；骨細胞增殖；毒理穩定性

隨著社會的發展，中老年人群中骨質疏松癥的患者逐年增加，目前國內外醫學界越來越重視該病的防治工作[1]。鹿壽春堂鹿骨鈣以馬鹿骨為核心組方，主要成分包括骨膠原，必須氨基酸以及鈣、維生素D等，對于增加骨密度，防治骨質疏松具有一定的療效。本實驗采用MTT法檢測鹿骨鈣溶液對骨細胞增殖的影響，并擬采用小鼠急性毒性實驗對鹿壽春堂鹿骨鈣進行初步毒理學穩定性評價，希望為該產品在臨床效果以及安全性的研究提供依據。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 鹿壽春堂鹿骨鈣片；MC3T3-E1成骨細胞；DMEM培養基購自Gibico公司；FBS購自杭州四季清公司；健康小鼠購自湖南農業大學實驗動物養殖場；CO2細胞培養箱購自Thermo公司；；ZHJH-1214C型超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠；UV-2550紫外可見分光光度計購自日本島津；其余所有試劑均為分析純水平。

1.2方法

1.2.1 MTT比色實驗 將培養瓶中MC3T3-E1成骨細胞用胰蛋白酶消化后離心，重懸，記數，稀釋后接種于96孔板中，置于37℃，5%CO2恒溫箱中培養，24h后粉碎鹿骨鈣片，用溫浴的含10%FBS的DMEM培養基稀釋成不同濃度接種到96孔板中，使最終細胞培養液濃度為8000、4000、1000、400、150、75、10、5μg/ml，每個濃度設置5個重復孔，剩余樣品孔加入等量的培養基作為對照，將96孔板置于37℃，5%CO2恒溫箱中繼續培養。干預48h后，每孔加入10μlMTT溶液（5 mg/m1），37℃孵育4 h，終止培養，在酶聯免疫檢測儀上選擇490nm波長，測定96孔板各孔光吸收值（OD值）。

1.2.2小鼠急性毒性實驗 經過預實驗，鹿骨鈣制劑低于8500mg/kg時，小鼠均未發生死亡，因此未測出LD50。故采用最大耐受量實驗。取鹿骨鈣粉碎，用無菌水配成最大濃度為340mg/ml的混懸液。取小鼠20只，雌雄各半，分為對照組和實驗組各10只，對實驗組小鼠禁食12h后，一次性按照體重標準25ml/kg給予灌胃，對照組小鼠禁食12h后，給予等量無菌水灌胃處理，灌胃后連續觀察14d，記錄小鼠中毒表現及死亡情況。

1.3統計學處理 應用SPSS13.0軟件分析數據，計量資料用（x±s）表示，計數資料用%表示，t檢驗比較分析，P<0.05，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測骨細胞增殖結果 不同劑量鹿骨鈣片干預成骨細胞48h后測得的OD值見表1，實驗結果表明，鹿壽春堂鹿骨鈣片溶液不同濃度對MC3T3-E1成骨細胞增殖影響不同，8000、4000μg/ml的鹿骨鈣片溶液檢測到的OD值比對照組的低，且差異顯著（P<0.05），表明在這個濃度下成骨細胞增殖受到抑制。1000、400、150、75μg/ml的鹿骨鈣片溶液檢測到的OD值比對照組的高，并且隨鈣溶液濃度增加OD值增加（P<0.05），因此在這個濃度范圍內鹿骨鈣片有促進骨細胞增殖作用并且顯示了一定的濃度依賴性。10、5μg/ml的鹿骨鈣片溶液效果與對照組相比無差異（P>0.05），表明此濃度鈣片溶液對成骨細胞增殖作用效果同細胞培養液。

2.2小鼠急性毒性實驗結果 小鼠以8500mg/kg劑量灌胃后，在連續的觀察周期中并未表現出中毒癥狀，也未出現死亡。第15d處死小鼠后分別解剖實驗組和對照組小鼠，經檢查，各主要臟器沒有出現明顯異常改變。因此，鹿壽春堂鹿骨鈣片屬于安全無毒物質。

3 討論

骨質疏松是以骨組織顯微結構受損，骨礦成分和骨基質等比例不斷減少，骨質變薄，骨小梁數量減少，骨脆性增加和骨折危險度升高的一種全身代謝障礙的疾病。臨床導致骨質疏松的原因很多，鈣的缺乏是被大家公認的因素[2-3]。但隨著人們飲食習慣、生活習慣、周圍環境及情緒等因素影響，人們呢的體液大多數均趨于酸性。因此，酸性體質是鈣質流失、骨質疏松的重要原因[4-5]。而臨床研究表明，成骨細胞增殖受到抑制是中老年人產生骨質疏松癥的細胞學機制[3]之一，本次研究通過體外實驗表明，在一定濃度范圍內，鹿壽春堂鹿骨鈣對于成骨細胞增殖具有促進作用，這表明，鹿壽春堂鹿骨鈣可能能夠通過刺激成骨細胞增殖，增加骨密度來達到防治骨質疏松癥的效果[6]。另外，本實驗表明鹿骨鈣片對小鼠的最大耐受劑量（LD50）大于8500mg/kg，且解剖實驗表明該鈣片不能誘導小鼠主要臟器發生突變，屬于無毒級。因此，上述實驗結果表明，鹿壽春堂鹿骨鈣是一種安全的無毒級物質，對于未來在臨床防治骨質疏松癥上可能會有很好的效果。

參考文獻：

[1]陳亞麗，宋連新.老年骨質疏松患者的知識、自我管理和生活質量現況[J].中國老年學雜志，2012，32（22）：55.

[2]肖勝和.淺談骨質疏松的防治[J].中國醫藥指南，2014，（15）.

[3]王長軍，殷國勇，李翔.骨髓間充質干細胞與成骨細胞復合培養對成骨細胞增殖的影響[J].江蘇醫藥，201l，37（11）：1244-1247.

[4]李瑞玉，顏軍禮，李蒙，等.中藥復方對成骨細胞增殖及骨密度的影響[J].中國組織工程研究，2013，32（33）：55.

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[6]高博，楊柳，史淇月，等.人骨髓間充質干細胞中Notch信號上調對破骨細胞增殖的調控[J].中國骨質疏松雜志，2014，37（5）：1244-1247.

編輯/哈濤