結核分枝桿菌實驗室檢測方法的臨床研究

摘要：結核分枝桿菌是導致結核病發生的主要致病菌，傳染性強，具有較高的發病率和病死率。通常臨床診斷結核病時，對診斷方法要求高，需準確、快速、特異性診斷，同時可以準確判斷結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。目前結核分支桿菌實驗室檢測方法日益增多，而其檢測結果的敏感性和特異性并沒有顯著提高。本文就對結核分枝桿菌實驗室檢測方法進行綜述研究，以此尋求簡單方便、準確性高、應用廣泛的實驗室檢測方法。

關鍵詞：結核分枝桿菌；實驗室檢測方法；結核病

結核病是目前世界嚴重性慢性傳染病，在早期WHO就以對結核病發出緊急預告。結核分枝桿菌也可稱為結核桿菌，在1882年Koch證明其是結核病病原體[1]?，F今診斷技術、治療方法的改進與發展，相應降低了結核病的死亡率。但隨著而來的是結核分枝桿菌耐藥菌株的出現，使結核分枝桿菌耐藥率不斷上升，死亡率不減反增[2]。在治療和控制結核病時，主要是根據實驗室檢測方法早期準確對結核分枝桿菌的診斷?，F綜述如下文。

1細菌學診斷技術

1.1直接厚涂片法 直接厚涂片法操作簡單、方便快速，成本低廉，是臨床診斷結核病細菌學常用方法。相關資料顯示采取直接厚涂片法，其檢出率與普通涂片法相比，其高出率高達19%[3]，是《結核病診斷細菌學檢驗規范》中對結核病診斷的規定方法。

1.2集菌涂片法 集菌涂片法利用檢測標本體積或離心、浮游等方法，使標本中結核桿菌富集，操作復雜，應用少。

涂片法的應用，成本低廉，操作簡單，但敏感性約為37%，較低，特異性為94%[4]，無法有效準確區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。

1.3 BACTEC-TB-460快速檢測系統 BACTEC-TB-460快速檢測系統可對結核分枝桿菌代謝產物進行有效測定，于米氏7H12培養基中添加放射性14C量，陽性則為生長指數GI值超過19[5]。此種方法初代分離率較高，報告時間短，2d內可檢出陽性標本，而改良羅氏法最快需要約20d才可檢測出陽性結果，陰性檢測需2個月報告，而BACTEC-TB-460快速檢測系統只需1個月[6]。該法可分離分枝桿菌，在分枝桿菌藥敏試驗和菌型鑒定中得到廣泛應用。但該法污染率高，微量放射線，會污染環境，且操作技術水平要求高，價格高。

1.4變色液體培養基培養法 結核分枝桿菌在實施培養基中發現，含有多種維生素、抗生素、谷氨酸鈉、變色劑、馬血清等營養豐富的選擇性培養基。其培養基營養豐富，其檢測率高。相關學者[7]報道，痰標本陽性檢測時間約7d，發生率52%，污染率2.8%。在改良羅氏法檢測中檢出時間約20d，陽性率38%，污染率2.1%。

1.5 BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀 BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養儀在檢測結核分枝桿菌時，通過在MGTI培養管中置入檢測標本，管中營養成分和氧氣會被生長的分枝桿菌吸收，通過MGTI培養管中的氧氣濃度變化會相應改變熒光顯示劑。當氧氣消耗時會促使管內熒光指示劑釋放熒光。培養儀報警，陽性指示器紅色，且液晶顯示屏會顯示檢測結果陽性位置，此種方法可有效判斷分枝桿菌，并進行細菌的藥敏試驗。

1.6噬菌體生物擴增法 噬菌體生物擴增法是在1997年所發現的快速檢測結核分枝桿菌的新型技術[8]。噬菌體生物擴增法的應用，在噬菌體能感染、裂解結核分枝桿菌等基礎上，對檢測標本中MTB利用特異性MTB噬菌體快速使其感染和裂解；未感染MTB的噬菌體經殺病毒劑有效清除，繼續大量復制，以此裂解MTB，釋放子代噬菌體。子代噬菌體感染可生成敏感細胞，在瓊脂平板上肉眼可見敏感細胞菌苔的噬菌斑[9]。噬菌斑數量越多，結核分枝桿菌的數量也越多。

2免疫學診斷技術

2.1結核抗體檢測 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是至今診斷結核診斷常用方法，通過ELISA法可有效檢測患者血清中結核特異性抗體。斑點免疫層析試驗操作簡單、方便快速優于ELISA，可單人份測定。免疫印跡試驗特異性和敏感性較高，結合凝膠電泳與酶聯免疫技術[10]，可有效檢測血清結核抗體對活動性結核病，但操作較復雜，臨床應用少。

2.2結核抗原檢測 結核抗原是機體感染結核桿菌后常見物質，通過檢測結核抗原，可直接判斷結核桿菌的存在，降低患者因免疫應答較低致假陰性的出現，該法通過對結核病患者血清結核抗原進行檢測，以此判斷。在相關學者[11]報道中，采取結核抗原檢測方法檢測，其檢測敏感性高達84.17，特異性高達92.19%，可見，結核抗原檢測方法存在較高的敏感性及較強的特異性。

2.3細胞因子檢測 結核病患者在MT抗原激活下，血液或局部中T淋巴細胞、巨噬細胞或單核細胞會釋放白細胞介素2受體、R干擾素、膜IL-2受體及A腫瘤壞死因子[12]，通過檢測機體細胞因子，利用EILAS檢測方法，對患者血清、胸腔積液、腦脊液中細胞因子，可作為診斷結核病的輔助方法。

3分子生物學診斷技術

3.1定量PCT技術 此種方法在擴增時添加特異性熒光探針及引物，在定量PCT技術中，相應增加對引物及特異性熒光探針，通過根據熒光信號變化，以此對PCR整個過程進行實施實時監測，以標準曲線定量分析未知模板[13]，定量PCT技術較常規PCR相比，其具有更高的靈敏度，及更高的特異性，優于常規PCR。且常規PCR會帶來一定污染，而采取定量PCT技術，避免常規PCR所帶來的污染性，具有較高的自動化程度。

3.2分枝桿菌分子菌種鑒定 在鑒定分枝桿菌分子菌種時，其鑒定方法包括：PCR菌種鑒定、PCR直接測序鑒定、PCR限制性片段長度多肽性鑒定法、PCR-DNA探針鑒定法、PCR-基因芯片鑒定等方法[14]。PCR菌種鑒定、PCR直接測序鑒定、PCR限制性片段長度多肽性鑒定法、PCR-DNA探針鑒定法只能夠對部分菌種進行鑒定，PCR-基因芯片鑒定方法利用雜交測序對分枝桿菌菌種進行鑒定[15]，操作簡單快速。

3.3分子藥敏試驗 在對結核分枝桿菌耐藥基因突變進行檢測時，通過采取多種基因突變技術可有效檢測，一般分子機制可導致MT耐藥，通常在檢測時利用各種基因突變分析技術，可檢測出一定的耐藥性MT，但通常實際臨床檢測中依然存在耐藥分子機制。據相關資料顯示，多種基因突變技術檢測結核分枝桿菌耐藥基因突變時，未有效檢測出高達40%耐藥分離株[16]，未能檢測出耐藥基因突變。

4總結

在臨床實驗室檢測結核分枝桿菌時，常用方法涂片法、培養法、PCR法等，各種方法具有各自優勢，其檢測的靈敏度、特異性也各不相同。應掌握各種檢測方法的優勢和缺點，選擇準確有效的診斷方法，明確結核分枝桿菌的特點，與其他病菌之間的關系，以此有效檢測、診斷和鑒別結核分枝桿菌，為臨床對結核病的早期治療和控制提供必要的參考依據。

通常結核分枝桿菌生長速度緩慢，一般在分裂時，其間隔時間是在18h，因此在培養結核分枝桿菌時，需耗費較長的時間。為了提高臨床診斷確診率，需要有效統計分析我國體檢人員結核分枝桿菌的各項數據，使相關人員能夠初步了解和基本掌握結核分枝桿菌的陽性檢出率及相關的藥敏耐藥率，同時檢測人員必須要認識到結核分枝桿菌檢測各項技術的優劣性，選擇最佳檢測技術，必要時可聯合各項技術，以此提高結核分枝桿菌檢出率，準確判斷結核分枝桿菌，為臨床治療和診斷提供科學合理的參考依據。

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編輯/申磊