Hcy對人血管平滑肌細胞中microRNA—125b表達的影響

摘要：目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）對人血管平滑肌細胞中microRNA-125b表達的影響。方法 原代培養人臍靜脈平滑肌細胞，分為空白對照組，Hcy干預組（50、100、200、500 μM）共計5組；MTT法檢測細胞增殖活；熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達。結果 MTT法顯示Hcy 可以明顯促進VSMCs增殖（P<0.05），qRT-PCR法顯示Hcy干預各組中miR-125b表達下調（P<0.01），但兩者都不是劑量依賴關系，且都在100 μM Hcy處作用最明顯。結論 Hcy 促進VSMCs增殖可能是由于miR-125b的表達下調引起的。

關鍵詞：同型半胱氨酸；microRNA；血管平滑肌細胞；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R543.1+2 文獻標識碼：A

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）所致的心腦血管疾病是當今嚴重危害人類生命健康的疾病之一。血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖、浸潤功能的改變是AS形成的中心環節。大量研究表明同型半胱氨酸（Homocysteine， Hcy）是AS的獨立危險因子[1]，而研究顯示Hcy可以明顯促進VSMCs的增殖[2]。miR-125b是動脈平滑肌細胞主要表達的microRNA之一[3]。研究表明，miR-125b的表達在正常組織與AS病理組織中存在顯著差異，但是Hcy是否對miR-125b存在影響以及存在何種影響目前未見報道。因此，本研究擬培養原代血管平滑肌細胞，給予不同濃度的Hcy干預后，檢測其對VSMCs的增殖活性，并檢測miR-125b的表達，明確Hcy對miR-125b表達的影響，為進一步揭示Hcy在動脈粥樣硬化中的作用提供理論基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 人主動脈平滑肌細胞株購自美國ATCC公司；DMEM/F-12培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Sino-America Biotech；同型半胱氨酸、MTT購自美國Sigma-Aldrich；miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及檢測試劑盒購自北京天根；熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1人主動脈平滑肌細胞培養 培養液為含 10%胎牛血清 青霉素100 U/ml 鏈霉素100 g/ml 的 DMEM/F-12培養基， 置于37℃ 飽和濕度 5% CO2 培養箱培養。

1.2.2 MTT檢測VSMCs增殖活性 將VSMCs消化后，以每孔103～104的密度接種到96孔培養板中，每孔終體積為200 μl。繼續培養待細胞進入對數生長期后，避光條件下每孔加入MTT 20 μl，37℃繼續孵育4 h后，小心吸棄孔內的培養液。每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min。每組設6個復孔。利用酶標儀在490nm波長下測定各孔吸光度值，記錄并分析結果。

1.2.3熒光定量PCR檢測miR-125b的表達 按照試劑盒說明書提取總miRNA，之后逆轉錄為cDNA，以此為模板進行熒光定量PCR檢測miR-125b的表達；miR-125b引物序列：上游5'-GGGTCCCTGAGACCCTAACTTGT-3'，下游5'-GCTGTCAACATACGCT ACGTA-3'，擴增產物78 bp；反應條件：94℃預變性3 min，94℃ 變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 次循環。以U6為內參照，根據PCR儀自動生成的Ct值，根據公式計算目的基因的相對量：相對表達量=2-△△Ct。

1.3統計學處理 結果以（x±s）表示。應用SPSS 11.0統計學軟件進行統計學分析，采用One-way ANOVA進行多樣本均數間比較，以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1 Hcy對VSMCs增殖的影響 MTT結果顯示不同濃度Hcy干預VSMCs后，Hcy可以明顯促進VSMCs細胞的增殖活性，但并不呈劑量依賴關系，但并不是劑量依賴關系，在100 μM Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 Hcy對miR-125b的表達的影響 qRT-PCR法檢測各組VSMCs中miR-125b的表達，結果顯示，Hcy可以明顯抑制miR-125b的表達，但并不呈劑量依賴關系，在100 μM Hcy處作用最明顯，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。

3討論

microRNAs（miRNAs）在生物體基因調控中發揮了重要作用，主要通過轉錄后水平發揮基因沉默效應。miRNA雖然大約只占人類預測基因的3%以上，但卻調控大約30%的蛋白編碼基因，涉及細胞的增殖、分化等。不同組織和細胞具有特異性的miRNAs，比如miR-142和miR-223在造血系統特異性表達，miR-1、miR-30c和miR-26等在心肌細胞中特異表達[4]；而動脈血管平滑肌細胞主要表達的miRNA為miR-125b 、miR-145及miR-143 等[3]。miR-125b不僅在正常組織不同部位表達不同，在正常組織與病理組織中miRNAs的表達也存在明顯差異，Tatsuguchi M等首次在大鼠頸動脈球囊損傷模型中發現miR-125b等表達下調[5]；Ruirui Ji等利用基因芯片的技術檢測了頸動脈泡沫樣損傷大鼠模型頸動脈中microRNA的差異表達，也發現miR-125b的含量下調[6]，這些都提示miR-125b通過參與VSMCs的生物學進程影響了AS的發生發展。而本課題研究發現，在Hcy干預下的VSMCs中，miR-125b低表達，提示Hcy通過影響Hcy的表達參與了VSMCs的增殖過程。此過程并不是劑量依賴關系，對此，我們分析可能的原因是：過高濃度的Hcy導致了其他的反應，如氧化應激、內質網應激、炎癥反應等，這些反應導致了VSMCs的損傷而失去其正常狀態；或者是Hcy導致的這些反應因為Hcy濃度的過高而超出了VSMCs自我修復的范圍，打破了損傷與修復的平衡，從而導致了以上結果的發生，也提示有更生層次的機制存在。

綜上所述，本課題首次發現在Hcy導致AS的發生發展過程中，其可能是通過影響miR-125b的表達促進了VSMCs增殖。

參考文獻：

[1]Sobczak AJ. The effects of tobacco smoke on the homocysteine level--a risk factor of atherosclerosis[J].Addict Biol，2003，8（2）：147-158.

[2]Tang L， Mamotte CDS， Van Bockxmeer FM， et al. The effect of homocysteine on DNA synthesis in cultured human vascular smooth muscle[J].Atherosclerosis，1998，136：169-173.

[3]Sébastien S. Hébert. Putative Role of MicroRNA-Regulated Pathways in Comorbid Neurological and Cardiovascular Disorders[J].Cardiovasc Psychiatry Neurol，2009，24（34）： 5848-5856.

[4]Marilena V Iorio Carlo M Croce. MicroRNAs in Cancer： Small Molecules with a Huge Impact[J].J Clin Oncol，2009，27（34）： 5848-5856.

[5]Tatsuguchi M， Seok HY， Callis TE， et al. Expression of microRNAs is dynamically regulated during cardiomyocyte hypertrophy[J].J Mol Cell Cardiol， 2007， 42（6）：1137-1141.

[6]Ruirui Ji， Cheng Y， Yue J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of microRNA in vascular neointimal lesion formation[J].Circ Res，2007，100：1579-1588.

編輯/肖慧