N—乙酰半胱氨酸對肺纖維化大鼠Smad3基因表達的影響

[摘要] 目的 探討N-乙酰半胱氨酸（NAC）對博萊霉素（BLM）誘導的大鼠肺纖維化模型Smad3表達的影響及意義。方法 選取2013年5～12月提供的健康Wistar大鼠60只，隨機分為四組，每組15只。A組：單純BLM處理組，B組：BLM處理及氫化可的松琥珀酸鈉干預組；C組：BLM處理及NAC干預組；D組：空白對照組。四組動物在給藥處理后的第7、14天和28天隨機處死5只；用免疫組化檢測肺組織中Smad3蛋白表達水平。結果 不同時期各組大鼠Smads 蛋白表達：A組Smad3 蛋白表達最強，B組次之（P<0.05），C組較B組差異無統計學意義（P>0.05），D組最低（P<0.05）。結論 NAC通過參與調控博萊霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織Smad3的表達，抑制大鼠肺纖維化程度。

[關鍵詞] 肺間質纖維化；N-乙酰半胱氨酸；Smad3；RT-PCR

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）02（a）-0089-02

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是谷胱甘肽（GSH）的前體，肺組織主要的抗氧化系統是由NAC/GSH及其氧化還原酶構成的，研究表明，氧化/抗氧化失衡是肺間質纖維化的重要機制之一[1-2]。此外，越來越多的證據表明多種細胞因子共同參與是導致肺間質纖維化的主要原因，其中轉化生長因子β（TGF-β）是最重要的促纖維化的因子之一。而Smads蛋白中Smad3是TGF-β/Smad信號傳導通路中的主要信號蛋白。2013年5～12月該研究通過建立博萊霉素誘導的大鼠肺間質纖維化模型，觀察NAC干預對Smads家族成員Smad3表達的影響，在分子水平上研究NAC對肺間質纖維化的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年5～12月取Wistar大鼠60只（由大連醫科大學動物中心提供），周齡4～6周，體重180～220 g，隨機分為4組，每組各15只。A組：單純BLM處理組，采用Tang H等[3]研究方法制備肺纖維化模型；B組：BLM處理及氫化可的松琥珀酸鈉干預組，模型制備同A組方法，此外每日給予氫化可的松琥珀酸鈉（25 mg/kg）腹腔注射；C組：BLM處理及NAC干預組，模型制備同A組方法，但于BLM處理后每天（至處死）強飼法口服NAC（3 mmol/kg）；D組：空白對照組，參照Tang H等[3]的方法氣管內注入生理鹽水代替博來霉素。四組動物在給藥處理后的第7、14 天和第28天隨機處死5只，取大鼠肺組織進行免疫組化處理。

1.2 支氣管肺組織病理改變觀察

利用免疫組化染色以及圖像分析技術。免疫組化結果判定：①對細胞著色強度進行計分：將肺泡巨噬細胞著色深淺分用0～4分四級計分；②對陽性細胞進行百分比計分：標記指數根據陽性細胞數所占百分比得出，即U=陽性細胞數/200個巨噬細胞（成纖維細胞）×100%分為I-V五級計分。①×②即為該例標本的免疫組化判定分值。

1.3 統計方法

數據處理采用SPSS 13.0統計學軟件進行。用均數±標準差（x±s）表示所有計量資料，等級計數資料轉化為計量資料，具體方法如下：0分表示0級，1分表示I級，2分表示Ⅱ級，3分表示Ⅲ級。顯著性分析采用單因素方差分析進行。

2 結果

2.1 肺組織病理變化

對病理半定量進行評分，結果如下：D組未出現明顯病理改變情況。A組第7天有大量炎性細胞浸潤，出現肺泡間隔明顯增寬情況，14 d出現大量成纖維細胞、平滑肌細胞，伴有膠原纖維沉積，28 d可見雙肺大量纖維化形成，肺泡結構破壞，毛細血管管腔較前明顯增厚，但炎性細胞較前減少。B組和C組肺泡炎和纖維化程度均較A組有所減輕（P<0.05）。C組同B組相比較，肺泡炎和纖維化程度差異無統計學意義（P>0.05），但仍較D組嚴重（P<0.05）（表1）。

2.2 肺組織Smad3蛋白表達

各組Smad 3蛋白表達（見表2，免疫組化染色圖片見圖1～3）結果如下：D組于少量血管內皮細胞、支氣管粘膜上皮細胞胞漿呈弱陽性表達。A組在巨噬細胞、肺泡上皮細胞及增生的成纖維細胞胞漿中呈強陽性表達。B組和C組蛋白表達強度明顯弱于A組（P<0.05），C組同B組相比較，蛋白表達強度差異無統計學意義（P>0.05），但仍高于D組（P<0.05）。見表2。

表2 肺組織Smad3蛋白表達評分比較（x±s）

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，●P<0.05；與B組比較，★P>0.05。

圖1 第7天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

圖2 第14天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

圖3 第28天時Smad3蛋白免疫組化染色圖片（×100）

3 討論

肺間質纖維化是一種彌漫性肺實質的漸進性疾病，其具體發病機制目前尚未闡明?，F階段主要應用糖皮質激素和細胞毒類藥物， 毒副作用較大，效果欠佳。

多項研究表明，氧化應激與氧化-抗氧化失衡在肺間質纖維化的發生發展過程中起著關鍵作用[4]。作為抗氧化劑GSH的前體物質，NAC可補充損傷肺組織缺失的GSH水平，提高纖維化疾病患者的肺部功能。NAC通過提高細胞內GSH水平方式，抑制轉化生長因子β （TGF-β）表達，從而降低TGF-β誘導的膠原合成[5]。TGF-β是致纖維化的關鍵性細胞因子，它通過促進成纖維細胞增殖及聚集，將成纖維細胞表型轉化為成肌纖維細胞表型，使成肌纖維細胞參與細胞外基質的沉積，這在肺纖維化的發病機制中起重要作用[6]。Smads作為TGF-β下游的信號蛋白，是將TGF-β信號從細胞外轉入細胞內的關鍵因子。為此該研究分析了Smads在NAC治療后大鼠肺纖維化模型中蛋白水平的表達情況，研究發現在活化的成纖維細胞和肺泡上皮細胞內均見Smad3表達，且隨肺纖維化程度加重，Smad3表達水平增高。經NAC和激素治療后Smad3表達水平降低，提示NAC可能是通過下調TGF-β通路關鍵因子Smad3的表達實現抗纖維化作用的。唐志宇等[7]研究表明鱉甲煎丸能夠減輕博萊霉素導致的大鼠肺纖維化程度，其作用機制與調控TGF-β的Smad蛋白表達有關。Meurer等[8]在體外培養的肝臟細胞研究中發現，NAC通過破壞分子間二硫鍵，改變了TGF-βRIII的結構，降低與TGF-β1的親和性，抑制構成TGF-β信號通路的重要分子Smad3的磷酸化，從而抑制TGF-β信號通路的各個方面。

綜上所述，抗氧化劑NAC通過抑制Smad3實現BLM誘導的肺纖維化大鼠的保護作用。但肺纖維化作用機制錯綜復雜，故還需進一步探索。

[參考文獻]

[1] Cho WS， Duffin R， Howie SE， et al.Progressive severe lung injury by zinc oxide nanoparticles； the role of Zn2+ dissolution inside lysosomes[J]. Part Fibre Toxicol，2011，8：27.

[2] 王文俊，張德平.姜黃素對與A549細胞共培養的肺成纖維細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制 [J].中國呼吸與危重監護雜志，2013， 12（3）：289-292.

[3] Tang H， Mao J， Gao L， et al.Effect of antisense TIMP-1 cDNA on the expression of TIMP-1 and MMP-2 in lung tissue withpulmonary fibrosis induced by bleomycin[J].Mol Med Rep，2013，7（1）：149-153.

[4] Cheresh P，Kim SJ，Tulasiram S，et al.Oxidative stress and pulmonary fibrosis[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）：1028-1040.

[5] Li S， Yang X， Li W，et al.N-acetylcysteine downregulation of lysyl oxidase activity alleviating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]. Respiration，2012，84（6）：509-517.

[6] 袁媛，楊方，徐洪.Ac-SDKP對ROCK通路介導的肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的調節作用 [J].中華勞動衛生職業病雜志，2013，31（9）：654-660.

[7] 唐志宇，李天朗，唐小賓.鱉甲煎丸對肺纖維化大鼠TGF-β1及smad信號通路的影響 [J].世界中醫藥，2011，6（6）：522-523.

[8] Meurer SK， Lahme B， Tihaa L， et al. N-acetyl-L-cysteine suppresses TGF-beta signaling at distinct molecular steps： the biochemical andbiological efficacy of a multifunctional， antifibrotic drug[J]. Biochem pharmacol， 2005， 70（7）：1026-1034.

（收稿日期：2014-11-09）