Caco—2細胞缺氧復氧損傷時母乳對促炎細胞因子表達的影響

[摘要] 目的 研究母乳對壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis， NEC）炎癥細胞的分子保護機制。 方法 通過建立Caco-2細胞缺氧復氧損傷模型，向正常細胞和缺氧復氧損傷模型細胞分別加入常規培養液、未加熱乳清、加熱滅活乳清。繼續培養6 h后用ELISA法檢測Caco-2細胞分泌于培養液中的促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。 結果 正常細胞組，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調IL-1β、IL-6水平，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調明顯，兩者之間差異有統計學意義；缺氧復氧損傷后IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調IL-1β、IL-6、TNF-α水平，差異有統計學意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調IL-1β明顯。 結論 母乳上清液可下調Caco-2炎癥細胞促炎細胞因子IL-1β、IL-6的表達，尤其缺氧復氧損傷后TNF-α也下調明顯，此類機制可能為母乳防治NEC的作用機制之一。

[關鍵詞] 壞死性小腸結腸炎；母乳；IL-1β；IL-6；TNF-α

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）02（a）-0001-03

The Impact of Human Breast Milk on the Expression of Proinflammatory Cytokine in Caco-2 Cells after Hypoxia/Reoxygenation

WANG Yujun RUAN Weiyong FENG Weiwei BU Weiquan BI Mingyuan

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu Province， 210028， China

[Abstract] Objective To study the mechanisms of breast milk in preventing necrotizing enterocolitis（NEC） through the level of cellular and molecular biology. Methods We induced Caco-2 cells model of NEC after hypoxia/reoxygenation. The normal cell group and model cell of hypoxia/reoxygenation group was divided into three subgroups： ①conventional culture fluid； ②unheated breast milk supernatant fluid； ③heat-inactivated breast milk supernatant fluid. All cells were continually cultured for six hours， then we detected the expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α proinflammatory cytokines secreted by Caco-2 cells in the nutrient fluid with ELISA method. Results In normal cell group， both unheated or heat-inactivated breast milk supernatant fluid could inhibit the expression of IL-1β and IL-6. Compared with the heat-inactivated breast milk supernatant fluid， the inhibition effect of unheated breast milk supernatant fluid was better， and the difference had statistical significance. The expression of IL-1β， IL-6 and TNF-α was obvious after hypoxia/reoxygenation， and unheated or heat-inactivated breast milk supernatant fluid could inhibit the expression of IL-1β， IL-6， TNF-α with statistical significance. Compared with the heat-inactivated breast milk supernatant fluid， the inhibition effect of unheated breast milk supernatant fluid on the expression of IL-1β was more obvious. Conclusion Breast milk supernatant fluid can inhibit the expression of proinflammatory cytokines IL-1β， IL-6 as well as TNF-α in Caco-2 cells especially after hypoxia/reoxygenation， this may be one of the mechanisms of breast milk in preventing NEC.

[Key words] Necrotizing enterocolitis； Breast milk； IL-1β； IL-6； TNF-α

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis， NEC）是新生兒尤其是早產兒時的嚴重胃腸道疾病，預后差，國內該病的病死率為10% ～50%[1]。研究證實，細胞凋亡是NEC早期腸上皮細胞死亡的主要形式，是NEC進一步發展的必經階段[2]。腫瘤壞死因子-α、脂多糖內毒素、血小板活化因子等在NEC的發病中起重要作用[3]。盡管目前對NEC發病機制研究取得很大進展，但分子生物學機制還沒完全闡明，缺乏特效的治療手段[4]。本實驗旨在通過母乳[5]干預Caco-2細胞缺氧復氧損傷， 研究其促炎細胞因子表達情況，探討母乳防治NEC的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 母乳成份上清液的提取

生后2～4 d的母乳（來自該院產科2012年6月—2013年12月正常分娩產婦）存于 4 ℃ 冰箱， 在24 h內處理， 12 000 r/ min離心10 min去除脂肪成分和細胞碎片， 保留乳清（未加熱乳清）用于實驗，通過煮沸5 min以滅活熱敏感蛋白或多肽，再次12 000轉/min離心10 min獲得上清液為滅活乳清，未加熱乳清和滅活乳清均存于-20 ℃ 冰箱備用。

1.2 Caco-2細胞培養

Caco-2細胞（細胞株購自中科院上海細胞庫）適宜在37 ℃、5% CO2和90%相對濕度的環境中培養，采用DMEM培養基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液。細胞培養在75 cm2培養瓶中，每5 d按1∶3的比例傳代，傳代后6～7 d細胞生長達到融合。

1.3 Caco-2細胞缺氧復氧損傷模型的建立

取傳代后第6天生長達到融合的Caco-2細胞，吸去90%的培養液，以減少氣體彌散距離，剩余培養液能維持細胞存活。將其置入密閉容器中，負壓抽吸其中空氣，換入高純氮氣，密閉后置入培養箱中孵育90 min（缺氧），再取出，加培養液至原量，置入培養箱中孵育30 min（復氧）[6]。

1.4 實驗分組

Caco-2細胞接種于6孔板，接種密度1×105/孔。分為正常細胞組和缺氧復氧損傷細胞組兩大組，每組均分小組：A組為常規培養液組（MEM）；B組為未加熱乳清組（以上制備的5% 乳清5%BM），C組為滅活乳清組（煮沸過的5%乳清5%BMb）。繼續培養6 h后用ELISA法檢測Caco-2細胞分泌于培養液中的促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.5 統計方法

該研究數據采用SPSS 21.0軟件包進行處理，計量資料采用均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。

2 結果

與MEM正常細胞組相比，MEM缺氧復氧損傷組IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，（t=16.112、9.468、6.593，P<0.05）；正常細胞組中：單因素方差分析，IL-1β、IL-6表達均較常規培養液組有，差異有統計學意義（P<0.05），TNF-α下降差異無統計學意義（P>0.05），LSD法進一步兩兩比較，BM組IL-1β下降較BMb組更多，差異有統計學意義（P<0.05），BM組和BMb 組IL-6差異無統計學意義（P>0.05）。缺氧復氧損傷細胞組中：單因素方差分析，IL-1β、IL-6、TNF-α表達均較MEM組差異有統計學意義（P<0.05），LSD法進一步兩兩比較，BM組IL-1β下降較BMb組更多，差異有統計學意義（P<0.05），BM組和BMb 組之間的IL-6、TNF-α下降差異無統計學意義（P>0.05）。Caco-2細胞分泌于各培養液中的促炎因子水平比較，見表1。

表1 Caco-2細胞分泌于培養液中的各促炎因子水平（x±s）

3 討論

新生兒壞死性小腸結腸炎（NEC）是新生兒尤其是早產兒常見的消化道危急重癥，其診斷和治療仍然面臨很多困難。迄今為止，NEC的病因及發病機制尚未完全明確，目前認為是由于早產、缺氧、低體溫、喂養不當、腸道缺血、感染等多種因素綜合作用所致。母乳喂養是一個保護因素，據報道人工喂養兒比母乳喂養兒NEC的發病率明顯提高，因母乳含有多量的表皮生長因子等，能有效預防發生壞死性小腸結腸炎[7]。該實驗中，體外培養了與人腸上皮細胞生物學功能相似的人結腸腺癌細胞系，從細胞及分子生物學水平進一步探討母乳防治NEC的有效性及具體作用機制。

Caco-2細胞來源于人體結腸腺癌細胞，同源性好。由于Caco-2細胞在培養條件下可自發進行上皮樣分化并可形成緊密聯結，其形態學、標志酶的功能表達及滲透特征與小腸類似，可以作為研究小腸表皮細胞的藥物轉運、吸收和代謝的體外模型。因而被國內外大多數實驗采用。

細胞因子是指主要由免疫細胞分泌的小分子多肽，具有介導和調節免疫、炎癥和造血過程的功能，對機體感染、免疫應答、炎癥以及創傷具有重要的調節作用。促炎細胞因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ等。腸缺血/再灌注損傷是腸粘膜屏障功能損傷的常見原因，已經證實，缺血/再灌注可激活內皮細胞，引起局部細胞因子網絡的失衡及某些細胞因子、粘附分子的過度表達，從而引起白細胞介導的組織損傷[8]。該實驗缺氧復氧損傷細胞組促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯表達，與文獻報道一致，進一步證實細胞因子網絡的失衡與NEC發病機制有關。

前期實驗中，1%和5%母乳上清液對Caco-2炎癥細胞均有抑制作用，后者作用略為明顯，但差異無統計學意義（P>0.05），該實驗綜合考慮選擇5%母乳上清液作為實驗用濃度。正常細胞組，未加熱乳清和加熱滅活乳清均可下調IL-1β、IL-6水平，但下調TNF-α差異無統計學意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調IL-1β明顯，差異有統計學意義；缺氧復氧損傷細胞組，未加熱乳清和滅活乳清均可下調IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具有統計學意義，未加熱乳清較加熱滅活乳清下調IL-1β更明顯，差異有統計學意義。說明母乳可下調Caco-2炎癥細胞促炎細胞因子（IL-1β、IL-6）的表達，尤其缺氧復氧損傷后下調均有統計學意義（IL-1β、IL-6、TNF-α），進一步證明此機制可能為母乳防治NEC的作用機制之一。母乳含有多種有生物學作用的有效成分，加熱滅活熱敏感蛋白或多肽可能影響這些成分的生物學作用，與未加熱乳清比較，對IL-1β部分影響的差異有統計學意義，可能與采用的濃度相關，今后的研究可關注濃度含量的影響[9]。

NEC的發病機制復雜，研究表明可能與Toll樣受體（Toll-like receptor， TLR）、核轉錄因子信號傳導的異常激活等相關[10]。對細胞因子調控的分子機制，如母乳對腸上皮細胞核轉錄因子、Toll樣受體表達如何影響，正在系列研究中將作進一步探討。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-10-21）