動物源性食品中氯霉素殘留檢測方法的優(yōu)化

摘 要：本文以GB/T 20756-2006檢測標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，在試驗(yàn)前處理和上機(jī)測定方面優(yōu)化了可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。樣本在堿性條件下，用乙酸乙酯提取，提取液吹干后，殘?jiān)盟芙猓?jīng)正己烷液分配脫脂后，過0.22 μm濾膜上機(jī)，采用電噴霧電離負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行測定。0.1 μg/L、0.3 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L等6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r=0.997 1，方法檢出限確定為0.04 μg/kg，0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg等3個加標(biāo)試驗(yàn)變異系數(shù)分別為6.45 %、14.38 %、10.34 %，回收率范圍分別為70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～108.00 %，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。通過回收率和多種食品樣本的實(shí)測實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測，適用于檢測可食動物肌肉、肝臟以及水產(chǎn)品中的氯霉素殘留。

關(guān)鍵詞：氯霉素；檢測方法；優(yōu)化

中圖分類號：S859.79+6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）07-0066-03

氯霉素是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素，白色針狀或微帶黃綠色的針狀、長片狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味苦，在甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇中易溶，在干燥時穩(wěn)定，在弱酸性和中性溶液中較安定，煮沸也不見分解，遇堿類易失效，屬抑菌性廣譜抗生素。敏感菌有腸桿菌科細(xì)菌及炭疽桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、李斯特氏菌等；衣原體、鉤端螺旋體、立克次體也對本品敏感。用于治療由傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、布氏桿菌、肺炎球菌等所引起感染的抗菌作用機(jī)制是與核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成。

氯霉素對造血系統(tǒng)有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。由于氯霉素引發(fā)的再生障礙性貧血是非劑量依賴的，美國FDA認(rèn)為：不可能通過建立允許殘留量和休藥期來控制氯霉素殘留的危害。也就是說，氯霉素的殘留量不論為多少都可認(rèn)為對人體健康是有害的。近年來，鑒于氯霉素對公眾健康可能造成的危害問題日益嚴(yán)重，世界各國和組織紛紛加強(qiáng)了對食品中氯霉素殘留的控制。2002年年初起，動物源性食品氯霉素殘留問題給中國的食品出口帶來極大的影響。歐盟宣布：“自2002年l月31日起禁止從中國進(jìn)口供人類消費(fèi)或用作動物飼料的動物源性產(chǎn)品。”使我國當(dāng)年在歐盟市場丟掉13萬t水產(chǎn)品的市場份額和造成6億多美元的經(jīng)濟(jì)損失。同年2月7日，英國以氯霉素超標(biāo)為由停止銷售中國蜂蜜。歐盟其他國家紛紛效仿，以抗生素殘留超標(biāo)為由將中國蜂蜜擋在國門之外，同時美國、日本、加拿大等其他國家相繼提高了對中國動物源性食品中藥物殘留的檢出限量。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部于2002年4月9日頒布了《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告 第193號》，其中食品生產(chǎn)用動物禁用的獸藥及其他化合物清單中就包含了氯霉素及其鹽、酯制劑。而氯霉素殘留的檢測方法目前報(bào)道的有很多，主要有以下幾種：金標(biāo)試紙條法、酶聯(lián)免疫分析法、放射性免疫分析法、微生物法、氣相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等等。

其中，高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法具有靈敏度較高、可準(zhǔn)確定性定量、操作更方便、受環(huán)境影響較小等優(yōu)點(diǎn)，如在GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008檢測標(biāo)準(zhǔn)中均使用此方法，氯霉素的檢出限可達(dá)到0.1 μg/kg。經(jīng)過不斷探索和試驗(yàn)，我們在《GB/T 20756-2006 可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的基礎(chǔ)上，對其前處理操作及儀器參數(shù)方面都進(jìn)行了優(yōu)化，具體如下：

1 儀器與主要試劑

1.1 所用儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀Waters AcQuity UPLC / XoVo TQMS，百位電子天平，離心機(jī)，氮吹儀。

1.2 主要試劑

氯霉素及氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司），乙酸乙酯（色譜純），氨水，無水硫酸鈉（經(jīng)600 ℃、3 h烘干）。正己烷（色譜純）濾膜（津騰：0.22 μm，有機(jī)相），二次蒸餾水等。

2 試驗(yàn)方法

稱取5 g試樣，精確至0.01 g。置于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)工作液（氯霉素-D5），加入20 mL乙酸乙酯，0.5 mL氨水，5 g無水硫酸鈉渦旋60 s，震蕩15 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液4 mL，45 ℃氮?dú)獯蹈伞?1 mL水復(fù)溶，加4 mL正己烷，渦旋30 s，以5 000 r/min離心3 min，去上層正己烷，再重復(fù)一次。過0.22 μm有機(jī)相濾膜，上機(jī)測定。

3 上機(jī)測定

液相色譜及質(zhì)譜條件：

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 3.0 mm×100 mm）或相當(dāng)者；

柱溫：40 ℃；

流動相：甲醇+水（40+60）；

流速：0.300 mL/min；

進(jìn)樣量：5.0 μL；

離子源：電噴霧離子源；

掃描方式：負(fù)離子掃描；

檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；

電噴霧電壓：-1 750 V；

輔助氣溫度：500 ℃；

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表1。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L），待儀器基線穩(wěn)定后，對系列標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其相關(guān)系數(shù)r=0.997 1。

4.2 方法檢出限確定

以空白雞肉樣本為基質(zhì)，添加濃度為0.1 μg/kg，按照上述方法全過程進(jìn)行預(yù)處理和測定，平行樣本n=7，根據(jù)各樣本檢測值（0.09 μg/kg、0.09 μg/kg、0.10 μg/kg， 0.10 μg/kg、0.10 μg/kg、0.08 μg/kg、0.11 μg/kg），計(jì)算出平均值X（0.096 μg/kg）及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb（0.012 9），當(dāng)被分析物的回收率在70 %～120 %之間時，可計(jì)算檢出限為0.04 μg/kg。計(jì)算公式如下：

檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X

其中：k為置信因子，一般取3。

4.3 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

以空白雞肉樣本為基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg（圖2）。將加標(biāo)樣本和空白樣本按前述方法進(jìn)行處理，上機(jī)測試，結(jié)果見表2、表3和表4。

5 結(jié)果與結(jié)論

經(jīng)過60次的反復(fù)比較試驗(yàn)，與《GB/T 20756-2006》相比較，在前處理步驟方面：本方法把勻質(zhì)提取步驟代之以15 min充分振蕩提取，同樣可滿足原方法要求。在振蕩充分的前提下，由于提取液最終只需分取五分之一，則提取過程只需一次即可滿足原方法要求。在凈化方面，去脂的過程不在于正己烷量的多少，而在于凈化的次數(shù)，1 mL正己烷重復(fù)一次即可。這些優(yōu)化過程，既能滿足原方法要求，又節(jié)約了檢測時間及試劑耗材。

優(yōu)化參數(shù)如下：一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本溶液（0.1 μg/L，0.3 μg/L，0.5 μg/L，1.0 μg/L，5.0 μg/L，10.0 μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r=0.997 1；方法檢出限確定為0.04 μg/kg，亦能達(dá)到GB/T 20756-2006、GB/T 22338-2008檢測標(biāo)準(zhǔn)方法中氯霉素的檢出限；0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加標(biāo)試驗(yàn)變異系數(shù)分別為 6.45 %、14.38 %、10.34 %， 0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg加標(biāo)試驗(yàn)回收率范圍分別為70.00 %～80.00 %、76.00 %～108.00 %、86.00 %～ 108.00 %，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。通過回收率和多種食品樣本的60次實(shí)測實(shí)驗(yàn)證明：上述方法樣本前處理方法簡便、快捷、易操作，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的條件設(shè)置合理，相關(guān)參數(shù)優(yōu)化較佳，靈敏度較高，可準(zhǔn)確進(jìn)行定性、定量檢測，適用于檢測可食動物肌肉、肝臟以及水產(chǎn)品中的氯霉素殘留。□□

參考文獻(xiàn)：（6篇，略）