鴿Ⅰ型副粘病毒F基因的原核表達及其ELISA檢測方法的建立

摘 要：將鴿Ⅰ型副粘病毒F基因亞克隆到pGEX-4T-1載體中，并用大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌誘導表達。以純化的F蛋白為診斷抗原，建立鴿Ⅰ型副粘病毒間接ELISA檢測方法，用方陣法確定了間接ELISA檢測的最佳條件：抗原1∶128稀釋即抗原包被量為0.6 μg/孔，血清1∶400稀釋，與一抗的最佳作用時間為60 min，與酶標二抗的最佳作用時間為60 min，底物顯色的最佳作用時間為15 min。用該方法對實驗室保存的35份陽性血清和12份陰性血清進行檢測，結果陽性符合率達到97 %以上，陰性符號率達100 %。

關鍵詞：鴿Ⅰ型副粘病毒；F基因；原核表達；ELISA；檢測

中圖分類號：S852.4+3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）06-0059-03

鴿Ⅰ型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus Type 1，PPMV-1）病又稱鴿瘟或鴿新城疫，是一種由禽I型副粘病毒（Avian Paramyxovirus 1，PMV-Ⅰ）引起的一種急性、熱性、高度性傳染病。鴿Ⅰ型副粘病毒的基因組為一條單股負鏈RNA，長約15 kb，包括6個基因：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，其中F基因全長為1 662 bp。編碼553個氨基酸。融合糖蛋白（F蛋白）主要負責病毒與易感細胞發生融合、進入細胞和產生溶血，并對新城疫病毒的毒力起主要決定作用，因此對鴿新城疫F蛋白的研究具有十分重要的意義。

本試驗選取F基因部分序列在原核大腸桿菌中高效表達，對表達產物進行純化，以純化的F蛋白作為包被抗原建立間接ELISA檢測方法，并對其特異性進行初步檢測，為鴿新城疫F蛋白單克隆抗體的研制奠定了基礎，為進一步建立高效準確鴿新城疫的診斷方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

含鴿Ⅰ型副粘病毒F基因的大腸桿菌BL21（DE3）重組菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

IPTG、丙烯酰胺、雙甲基丙烯酰胺和十二烷基磺酸鈉購自Promega公司，酵母提取物、胰蛋白胨、中等分子量蛋白Marker、氨芐青霉素、Tris-Cl、DTT、考馬斯亮蘭、PEG4000等購自上海生工公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.3 血清

鴿Ⅰ型副粘病毒陽性血清35份，鴿Ⅰ型副粘病毒陽性血清12份均為本實驗室保存。

1.4 重組菌的誘導表達

將測序正確于-70 ℃保存的重組菌株PGEX4T-1-PPMV-1-F（924），劃線接種于LB瓊脂平板（Amp+）上，倒置放于37 ℃培養箱中培養12 h～16 h；然后挑取單個菌落接種于4 mL的LB培養液中（Amp+），37 ℃振蕩培養至細菌對數生長期；在將此菌以1 %的接種量接種于100 mL LB培養液（Amp+）中，37 ℃振蕩培養至細菌對數生長期，以1 %接種量接種于1 000 mL含LB培養液（Amp+）中，37 ℃培養至OD600=0.4時，加入IPTG進行誘導，之后收集菌體。用PBS（pH=7.4）懸浮菌體沉淀，加入1/100體積的溶菌酶10 μg/mL，室溫作用15 min。反復凍融3～4次后，在冰浴中超聲裂解至菌液澄清透亮；超聲條件為：功率18 W，超聲作用8 s，停6 s，連續超聲30 min左右，使菌體全部破碎；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用8 M尿素溶解，對表達產物進行SDS-PAGE分析。

1.4 包涵體蛋白的提取

將誘導的菌體8 000 rpm/min離心5 min，Buffer A溶液洗滌1次，用Buffer A重懸沉淀后強超聲波破碎2 min～3 min，至溶液為半透明。4 ℃ 10 000 rpm/min離心10 min，棄上清。用少許Buffer A輕輕洗滌沉淀。加入原細菌培養液體積1/10的Bueffr A溶液重懸沉淀，加入SKL（N-十二烷基肌氨酸鈉）室溫靜置2 h，使其沉淀緩慢溶解。4 ℃ 10 000 rpm/min離心10 min，棄沉淀，取上清，分別加入PEG 4000至2 %（w/v）、氧化型谷胱甘肽至l mM、還原型谷胱甘肽至2 mM，靜置30 min 2 h，轉至處理好的透析袋中，于0.01 M TE溶液（pH8.0）中透析2 d～3 d，取出用紫外風光光度計測OD260和OD280，計算蛋白濃度。提取蛋白立即使用或分裝，-20 ℃或-80 ℃保存備用。

1.5 ELISA方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋度的確定

取純化的重組鴿新城疫F蛋白用包被稀釋液做1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀釋；陰性、陽性血清用封閉液分別做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋后，用方陣法確定抗原及對照血清的最適工作濃度。

1.5.2 間接ELISA各工作條件的摸索

確定抗原與待檢血清作用時間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應板，封閉，抗原與待檢血清作用時間分別為40 min、 60 min、80 min，其它條件相同，計算P/N值，確定抗原與待檢血清最佳作用時間。

確定待檢血清與酶標二抗作用時間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應板，封閉，待檢血清與酶標二抗作用時間分別為 40 min、60 min、80 min，其它條件相同，計算P/N值，確定待檢血清與酶標二抗最佳作用時間。

確定底物顯色液最佳作用時間：采用抗原最佳包被濃度包被微量反應板，其它條件相同，加入OPD-H2O2底物顯色液，每孔加100 μL，室溫避光顯色10 min、15 min、20 min時分別用 2 mol/L H2SO4每孔50 μL終止反應，計算P/N值，確定底物顯色液最佳作用時間。

1.6 臨床樣本的檢測

應用建立的ELISA檢測方法對實驗室保存的35份鴿Ⅰ型副粘病毒陽性血清和12份陰性血清進行檢測，確定其特異性和敏感性。

2 結果

2.1 融合蛋白的表達與純化

對F蛋白進行誘導表達，超聲處理后，取上清和沉淀分別進行SDS-PAGE電泳，結果發現目的蛋白表達于沉淀中，融合蛋白大小約為60 kD，而上清中則無目的條帶出現，表明誘導產生的融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在，結果如見圖1所示。

2.2 純化蛋白的濃度

以0.01 M TE溶液做空白對照，將純化的重組蛋白用紫外分光光度計測定濃度，結果如下：

OD280=0.786

OD260=0.497

帶入公式樣本蛋白質含量（mg/mL）= （1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數

計算得蛋白濃度為：0.772 mg/mL

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 最佳抗原及抗體工作濃度的確定

用純化的重組鴿新城疫F蛋白包被ELISA平板，采用方陣法確定蛋白的最佳包被濃度及陽性血清的最佳稀釋倍數，結果見下表1。

從上表的F-ELISA方陣滴定結果表明，出 OD492 nm值為0.978時，P/N最大，此時F蛋白及陽性血清的稀釋度為最佳工作條件，抗原最佳包被濃度為1∶128，即0.6 μg/孔 的抗原包被量。血清最佳稀釋度為1∶400。

2.3.2 一抗作用時間的確定

測出抗原與陽性血清及陰性血清在不同時間作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作濃度），取平均值，計算P/N，結果見表2，當陰陽性血清與酶標二抗作用時間為60 min時，P/N值最大，故選擇與一抗作用時間為60 min。

2.3.3 二抗作用時間的確定

測出陽性血清及陰性血清與二抗在不同時間作用的OD492 nm值（抗原、血清均采用最佳工作），取平均值，計算P/N，結果見表3，當陰、陽性血清與酶標二抗作用時間為60 min時，P/N值最大，故選擇與二抗作用時間為60 min。

2.3.4 底物顯色液作用時間的確定

抗原、血清均采用最佳工作濃度，其它條件相同，測出陽性血清、陰性血清與底物顯色液不同作用時間的OD492 nm值，取平均值，計算 P/N，結果見表4，當底物液時間為15 min時， P/N值最大，且陽性OD492 nm>0.2，故選擇底物液作用時間為15 min。

2.4 臨床樣本的檢測

應用建立的間接ELISA檢測方法對實驗室保存的35份陽性血清和12陰性血清進行檢測，結果35份陽性血清應盡量的ELISA方法檢測出陽性34份，準確率達到97.14 %，對12份陰性血清用ELISA方法檢測結果全部為陰性，表明建立的間接ELISA檢測方法具有較好的特異性和敏感性。

3 討論與結論

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法自建立至今已經廣泛應用于各種細菌、病毒、寄生蟲病的診斷以及在腫瘤學、免疫病理學等方面已廣泛應用，該方法具有靈敏、準確、簡便等優勢。ELISA是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物的高效催化性結合起來的一種敏感性很高的檢測方法。間接ELISA是將已知的定量抗原吸附在反應板上，加入待測抗體，形成抗原抗體復合物，洗滌除去雜蛋白后加入酶標記的二抗，洗滌除去未吸附或多余的二抗，加入底物顯色，以顯色反應推知抗體量。該方法可以非常靈敏地檢測血清中的IgG抗體。

本實驗選用了PGEX-4T-1融合表達載體后，用PITG誘導，SDS-APGE凝膠電泳分析顯示，F蛋白為60 KDa左右，誘導產物在預計大小處有表達蛋白產生，是F蛋白片段34 KDa，再加上PGEX-4T-1載體自帶的26 Kda的GST標簽，所以F蛋白片段在PGEX-4T-1/BL21（DE3）中得到了穩定的表達，通過對表達產物處理后進行SDS-APGE電泳后發現，表達的蛋白都位于包涵體中。

把表達的蛋白進行純化作為包被抗原，建立間接ELISA檢測方法，用方陣法確定其最佳反應條件：抗原1∶128稀釋即抗原包被量為0.6 μg/孔，血清1∶400稀釋，與一抗的最佳作用時間為60 min，與酶標二抗的最佳作用時間為60 min，底物顯色的最佳作用時間為15 min。并把建立的方法進行了臨床樣本的檢測，具有較好的特異性和敏感性，為鴿新城疫的診斷、防治制劑的研制奠定了基礎。□□