影響血凝和血凝抑制試驗因素的探討與分析

摘 要：血凝抑制試驗具有所需器材簡單、操作方便、試驗結果判定快速等優點，但該試驗影響因素很多，常造成檢測結果出現較大偏差。本文從試驗器材、試劑、待檢血清、緩沖液、紅細胞、微量血凝板、環境溫度及其他影響因素進行綜合分析，旨在避免或減少不利因素的影響，提高試驗的準確性。

關鍵詞：禽流感；新城疫；產蛋下降綜合征；血凝抑制試驗；影響因素

中圖分類號：S852.5+3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2015）10-0059-03

血凝抑制試驗（HI）由于所需器材簡單、操作方便、試驗時間短等優點，是一種在基層臨床實踐中極易推廣的檢測手段與診斷方法。然而，在血凝抑制試驗方面，由于受個人技術、試驗條件、環境等諸多因素的限制與影響，影響了試驗結果的準確性，導致檢測結果不準確甚至錯誤。現分析如下。

1 器材的選擇和使用

為獲得準確的檢測結果，嚴格按相應的標準操作程序使用單道、多道移液器，使其始終保持最佳工作狀態。新購移液器在使用前、舊移液器在使用一段時間后均應進行校正或鑒定。選購正規廠家生產、質量較好的微量反應板、吸頭等一次性耗材。

1.1 單道、多道移液器使用注意事項

（1） 吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，不允許突然松開，以免因吸液過快，液體沖入加樣器內，使柱塞腐蝕而造成漏氣；

（2） 為獲得較高的精確度，在正式加樣前，按緊吸頭后先吸取溶液一次，濕潤吸頭，直接吸取因吸頭內壁應殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產生誤差；

1.2 96孔V型微量反應板

（1） 建議采用96孔110°V型有機反應板進行血凝試驗（HA），但注意不要使用底部磨損嚴重和底部不干凈的反應板。采用一次性優質塑料反應板（90°或110°均可）進行HI。

（2） 使用有機反應板進行HI時，建議按如下程序清洗：試驗結束后，立即用帶有壓力的自來水反復沖洗（以看不到孔底有紅血球為準），用力甩干孔內剩余的水滴，需要時反扣在吸水紙上排干。置2 %～3 %濃度的鹽酸浸泡過夜（12 h以上）后，撈出反應板并小心將孔內殘留鹽酸甩到鹽酸缸內，用自來水沖洗后，用蒸餾水沖洗2～3次，甩干水分置溫箱中烘干備用。及時淘汰損壞和底部洗不干凈的反應板。

（3） 不建議使用鑷子夾棉花或使用試管刷涮洗有機反應板凹孔，以免對反應板板面和孔內造成損傷。

（4） 建議購買材質較好的有機反應板，試驗前應盡可能挑選干凈、內孔壁平滑工整的反應板，避免因板子質量問題造成試驗結果的偏離。有機反應板材質有好有壞，價格便宜的反應板質量差、多內孔粗糙、V型底部不工整。因此在采購時，需要進行挑選。以減少因反應板對血球凝集和結果的判定產生影響。

2 選擇相應的檢測技術標準

HA與HI試驗，雖然原理相同、方法相似，但禽流感、新城疫和產蛋下降綜合征等病各自執行標準卻不盡相同，特別是有些關鍵環節存在較大差異。《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936-2003）、《新城疫診斷技術》（GB/T 16550-2008）和《產蛋下降綜合征診斷技術》（NY/T 551-2002）三個標準對HA與HI試驗中紅血球的離心速度要求存在明顯差異。NY/T 551-2002中抗原對照設置也不同于前兩個標準，所用稀釋液也非PBS，而是生理鹽水。并且前兩個標準與《SPF雞紅細胞凝集抑制試驗》（GB/T 17999.2-2008）中的要求也不相同。因此，不同的檢測項目應選用相應的檢測技術標準來開展檢測，確保試驗執行標準的統一性和規范化，是保證試驗結果準確性和一致性的重要前提。

3 配液用量具

配液時選擇精準度高的容量瓶、玻璃吸管和移液器。建議不要使用精準度低的量筒（特別是大量程量筒和圓錐形量筒誤差更大）和注射器，量筒一般用于精確度要求不是太高的液體配制（如洗液、消毒液等），普通注射器的準確性也不高。

4 試劑

4.1 稀釋液

4.1.1 磷酸鹽試劑

不同的檢測項目，要求使用的稀釋液（磷酸鹽緩沖液PBS）不同。特別是高致病性禽流感和新城疫檢測所用稀釋液采用的化學試劑有差異。磷酸鹽必須選用分析純的試劑，稱量前應注意選用相應要求的試劑，結晶水分子數不一樣或進行結晶水分子換算。

4.1.2 滅菌和pH值調整

配好的PBS須及時進行高壓滅菌或過濾。而且在高壓滅菌后，需要對稀釋液的pH值進行再次調整。PBS pH值必須滿足標準要求。

4.1.3 稀釋液

禽流感和新城疫試驗使用的稀釋液必須為0.01 mol/L pH值7.0～7.2的PBS，最好不要用生理鹽水，因為PBS對其他酸堿物質具有一定的緩沖能力，能維持反應體系的pH值，而生理鹽水不具備緩沖功能。試驗中使用的PBS在pH值在5.18以下，易造成紅細胞自凝，pH值在7.3以上時凝集的紅細胞洗脫加快，而pH值為7.0～7.2時紅細胞沉淀最充分，觀察效果最理想。

4.1.4 抗凝劑

選用分析純檸檬酸三鈉配制，濃度為3.8 %，配好后進行高壓滅菌。

4.2 1 %紅細胞制備

（1） 為防止血球發生自凝，采血時應用預先吸有3.8 %檸檬酸鈉采集至少3只SPF公雞無禽流感與新城疫等抗體的健康公雞血液，所采血液與抗凝劑按4∶1～5∶1的比例混合，采完后應及時把針管小心顛倒幾次，避免出現凝血塊或溶血。

（2） 離心洗滌紅細胞時，選擇10 mL左右的“V”型玻璃離心管進行紅細胞洗滌，建議不要使用5 mL或10 mL等大小的“U”型塑料離心管洗滌紅細胞，因“U”型離心管離心時紅細胞沉淀不徹底，進而影響洗滌效果，最終影響紅細胞質量。

（3） 按相應標準要求選擇不同的離心速度進行離心。禽流感抗體檢測1 000 rpm離心10 min，新城疫抗體檢測2 000 rpm離心5 min～10 min，產蛋下降綜合征抗體檢測2 000 rpm離心5 min 2次，第3次離心10 min。

4.3 抗原和陽性血清

（1） 新的未開封凍干抗原和陽性血清，按抗原瓶身說明要求用1 mL移液器取相應要求量的PBS（產蛋下降綜合征用生理鹽水）進行稀釋；

（2） 已稀釋配制好但暫時不使用的濃縮抗原、陽性血清和均應在冰箱4 ℃保存，有條件的實驗室4HAU抗原可放置在實驗臺面上的冰盒內。

（3） 4HAU抗原需現配現用。為驗證測出的濃縮抗原血凝價和4HAU抗原配制是否準確，須做4HAU抗原回歸試驗：取0.025 mL的PBS加入反應板的第2～6孔；將配制好的4HAU抗原 0.025 mL分別加入第1和2孔，然后從第 2孔依次倍比稀釋至第6孔，最后棄去0.025 mL；各孔再加PBS 0.025 mL，最后加1 %紅細胞懸液0.025 mL混勻，室溫靜置30 min觀察結果。若4HAU、2HAU和1HAU能使1 %紅細胞完全凝集，而1/2HAU、1/4HAU和1/8HAU不能完全抑制，說明4 HAU配制準確，否則需要重新測定濃縮抗原的HAU或對4 HAU濃度進行微調，直至抗原回歸試驗成立。

5 操作

（1） 使用微量移液器移液時慢吸慢放，以保證加樣的準確性和避免樣品和試劑加在孔壁上或濺出板孔產生氣溶膠。加樣時移液器吸頭應垂直加入液體，禁止與孔內液體接觸。不允許移液器吸頭插入反應板孔內液面下加液體，防止發生交叉污染；首次加液時盡量將所加液體加在V型板的底部，避免加在孔壁上部；

（2） 加樣的順序應該是由低濃度到高濃度，即先加低濃度孔（第12孔），后加高濃度孔（第1孔），以減少樣品加入時造成交叉污染；

（3） 倍比稀釋時不能速度太快、用力過猛，避免產生過多氣泡，使吸頭內有大量氣泡，造成移液量誤差，影響反應過程，造成檢測結果的偏離；

（4） 1 %紅細胞懸液在試驗過程中須隨時用隨時搖勻，使之呈均質狀態。

（5） 每個反應板盡量都要設置陰陽性對照，以驗證試驗是否成立。

6 孵育溫度與時間

孵育溫度對試驗的影響較大，溫度既影響HA與HI的滴度，也會影響反應的速度。從4 ℃～37 ℃，隨著溫度的上升，HA與HI的滴度隨之升高。溫度過低反應速度減慢，溫度過高會使反應結果洗脫加快，所以孵育溫度常控制在室溫（20 ℃～25 ℃）。此外，孵育時間須嚴格控制在20 min～40 min之間。HI試驗的反應時間與試驗環境溫度成反比，即環境溫度越高所需反應時間相對較短；環境溫度低于4 ℃時紅細胞可能發生自凝現象。因此，建議在反應20 min后，隨時觀察反應結果，摸索試驗終點時間，以便獲得最準確結果，若紐扣狀沉淀較小或發現淚流狀流淌線細，可加長孵育時間。

7 結果的判定

（1） HA結果判定以紅細胞完全凝集的病毒最大稀釋度為抗原凝集價。

（2） 在陽性血清對照、抗原對照和1 %紅細胞對照完全正確情況下，將微量反應板傾斜45°左右（不大于60°），孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒的為凝集完全抑制，能完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋度為HI滴度。HI滴度的判定受主觀因素影響較大，判定時需要與對照孔進行比對，與其淚滴大小、流速快慢一致的最后孔為其最終值。一般來說，以紅血球對照完全沉淀的前后5 min內判定試驗結果較好，大約在20 min～40 min左右。

8 小結

HA和HI試驗結果準確與否，試驗中的每個因素都有單獨和綜合的影響。因此，試驗中一是要嚴格按照相關標準要求操作，盡可能排除各種因素的影響或盡可能把影響降至最低，并在反復試驗的基礎上，固定試驗條件和判定時間，降低試驗誤差。否則就可能影響試驗結果的準確性或造成明顯偏離。二是要在反復實踐試驗的基礎上積累經驗和掌握熟練的技術，方能保證HA與HI試驗結果的準確性。進而為科學防控重大動物疫病提供有力支持。