貝母甲素含量測(cè)定方法研究進(jìn)展

摘要：綜述了貝母甲素含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展，包括紫外一可見(jiàn)分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜一差熱聯(lián)用技術(shù)等，為貝母甲素的含量測(cè)定提供參考。

關(guān)鍵詞：貝母甲素；含量測(cè)定；研究進(jìn)展

O引言

貝母甲素來(lái)源于百合科植物川貝母和浙貝母的干燥鱗莖。貝母甲素是一種生物堿，白色針狀晶體，可溶于有機(jī)溶劑，不溶于水、石油乙醚。貝母甲素有清熱潤(rùn)肺、止咳化痰功效，用于治療痰熱咳嗽，心肺郁積，咳嗽及氣管炎。目前貝母甲素含量測(cè)定方法很多，如分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法等。本文對(duì)其含量測(cè)定方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 紫外一一可見(jiàn)分光光度法

紫外——可見(jiàn)分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200～760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來(lái)的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。鄺翠儀等人發(fā)現(xiàn)貝母甲素在2368～11.84μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，貝母甲素平均回收率測(cè)定為97.7%，RSD=4.2%。尹尚軍等采用超聲波輔助提取法分離浙貝母生物堿，并用分光光度法測(cè)定其含量。結(jié)果表明，吸光度值與貝母素甲質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，不同產(chǎn)地對(duì)浙貝母生物堿含量的影響較大，而且不同組織部位的含量不盡相同。

2 薄層掃描法（TLC）

薄層掃描法檢測(cè)的靈敏度、結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度均良好。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應(yīng)，可同時(shí)平行分離分析多個(gè)樣品；流動(dòng)相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對(duì)樣品的預(yù)處理要求不高等優(yōu)點(diǎn)。在中藥制劑檢驗(yàn)中，已成為重要的常用分析方法之一。《中國(guó)藥典》中有33個(gè)中成藥品種采用該法進(jìn)行含量測(cè)定。

薄層掃描法的薄層板多采用硅膠G，展開(kāi)劑多采用氯仿一甲醇一水（65：35：10），顯色劑一般為10%硫酸乙醇。宋紅湘等用薄層掃描儀對(duì)婦康消腫丸中貝母素甲進(jìn)行了含量測(cè)定。其中做層析分析時(shí)，貝母素甲在502 nm處有最大吸收；掃描結(jié)果表明在0.41-2.05μg之間；積分值與點(diǎn)樣量間線性關(guān)系良好。經(jīng)加樣回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)表明測(cè)定結(jié)果可行。同時(shí)侯文峰等建議復(fù)方制劑成分復(fù)雜，可按干燥計(jì)算；薄層板展開(kāi)時(shí)盡量在低溫下展開(kāi)，溫度控制在60%-70%左右，分離效果較好。

3 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，具有高壓高效高靈敏度，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在中藥含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。

3.1 UV檢測(cè)器

紫外線檢測(cè)器（UV）原理是Lamber-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過(guò)流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分濃度C和流動(dòng)池光徑長(zhǎng)度成正比。UV檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn)是選擇性高、靈敏性好。廣泛適用于有機(jī)分子具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力的物質(zhì)檢測(cè)。

一般當(dāng)物質(zhì)在200-400nm有紫外吸收。吳曉民測(cè)不同產(chǎn)地平貝母中貝母甲素含量采用Kro-masil ODS C18（4.6mmx250mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇一水（69：31），體積流量為0.5mL.min-l；柱溫為27°C；檢測(cè)波長(zhǎng)為208nm，貝母甲素在0.515 -3.09μg與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.9997），平均加樣回收率為98.54%，RSD為2.12%（n=5）。本方法靈敏度高，而且簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好內(nèi)，可用于平貝母的內(nèi)在質(zhì)量控制。

3.2 ELSD檢測(cè)器

蒸發(fā)散射檢測(cè)器（EISD）原理適用于所有待測(cè)物的揮發(fā)性低于流動(dòng)相的分離。現(xiàn)在ELSD越來(lái)越多的作為通用性檢測(cè)器。它最大的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)不含發(fā)色團(tuán)化合物。如碳水化合物、脂類(lèi)等。并在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測(cè)未知化合物。ELSD廣泛應(yīng)用于皂苷類(lèi)成分、萜類(lèi)成分及生物堿成分分析。

貝母甲素通常采用Lichrospher C18，柱溫一般不超過(guò)40℃，流動(dòng)相為乙腈一水或甲醇一水，流速一般不超過(guò)ImL/min。趙琰玲等人采用高效液相色譜ELSD法測(cè)定參貝止咳片中的貝母素甲含量。選用色譜柱（250mmx4.6mm，Spm），柱溫30度，流動(dòng)相為乙腈-0.05%-乙胺溶液（70：30），流速為l.Oml/min，載氣（氮?dú)猓┝魉?.5L/min，漂移管溫度70度。貝母素甲進(jìn)樣量對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)具有良好的線性關(guān)系。該方法可靠準(zhǔn)確、重復(fù)性好可用于制劑含量測(cè)定及質(zhì)量控制。姜艷等人采用高效液相色譜ELSD法測(cè)定浙貝母中貝母素甲含量。采用色譜柱Agilent Hypersil BDS-C18（4.Omm×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈一水一二乙胺（70：30：0.03），流速0.8ml/min，漂移管溫度85度，載氣流速2.2L/min。貝母素甲線性范圍47.02～1003mg/L，平均回收率分別102.7%，RSD分別為2.1%（n=6）。此法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，可用于浙貝母質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.3 MS檢測(cè)器

質(zhì)譜法（MS）利用電磁學(xué)原理，對(duì)荷電分子或亞分子裂片依其質(zhì)量和電荷的比值進(jìn)行分離和分析的方法。質(zhì)譜法優(yōu)點(diǎn)分析速度快、靈敏度高、高分辨率。質(zhì)譜法廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中通過(guò)制備、分離、檢測(cè)氣相離子來(lái)鑒定化合物的一種專(zhuān)門(mén)技術(shù)。質(zhì)譜法具有高特異性和高敏感度且得到廣泛應(yīng)用的普適用法。

質(zhì)譜法多采用C18色譜柱。柱溫為室溫，流動(dòng)相為乙腈一水，流速不超過(guò)IMUmin。張杰雯等人[7]應(yīng)用高效液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)貝母生物堿中貝母甲素進(jìn)行檢測(cè)。貝母用氨水浸潤(rùn)后，以乙醚一氯仿一乙醇f25：8：2.5）超聲提取。將提取物直接進(jìn)樣到電噴霧離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式（ESI+），掃描范圍為m/z 210～800，貝母甲素的選擇性檢測(cè)離子分別為m/z 432。采用色譜柱為SphrigelC18（200mm×4.6mm，Sμm），流動(dòng)相為乙腈-lOmmol.L-1甲酸銨（pH=8.0，0.03%三乙胺），梯度洗脫（0～6min：乙腈300-/0一45%；6- 22min：乙腈45%；22 - 30min：乙腈450%→95%；30～34mni：乙腈30%），流速I(mǎi)mL.min-1，柱溫25℃。川貝母與浙貝母總生物堿提取液的一級(jí)質(zhì)譜圖顯示，其主要分子離子峰基本相同，相對(duì)豐度有較大差異。相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法回收率均大于97%，日內(nèi)、日間精密度（RsD）分別小于1.3%和2.8%（n=5）。本方法靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快捷，線性關(guān)系良好，適用于貝母中無(wú)紫外吸收的異街體生物堿的檢測(cè)與分析。俞瀅等人利用HPLC-MS測(cè)定癃閉康泰片中貝母甲素含量。癃閉康泰片經(jīng)堿化，用氯仿一甲醇（4：1）提取生物堿有效部位，提取液濃縮，殘?jiān)眉状既芙夂螅M(jìn)行高效液相色譜一質(zhì)譜測(cè)定。色譜柱為AgilentZorbax extend C18（2.1 mmxl00 mm，Sμm），流動(dòng)相為乙腈和10 mmol.L-1甲酸銨（pH 8.0），梯度洗脫（0～15 min：乙腈30%～55%；15～25min：乙腈55%），流速0.2mL.min-l，柱溫30℃。質(zhì)譜條件為電噴霧電離源（ESI），以選擇性正離子方式檢測(cè)，貝母素甲的選擇性檢測(cè)離子分別為m/z 432.4。貝母素甲的線性范圍均為0.01～10 mg.1-l，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢測(cè)限均為0.45μg- 1-1，方法回收率均大于95%，日內(nèi)日間精密度（RSD）均小于5%。本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性關(guān)系良好，操作簡(jiǎn)便，適用于癃閉康泰中貝母素甲含量測(cè)定。

4 其他方法

4.1 高效液相色譜一差熱聯(lián)用技術(shù)（HPLC-DTA）

高效液相色譜一差熱聯(lián)用技術(shù)，方法簡(jiǎn)便，快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及質(zhì)量檢驗(yàn)。程存歸等用高效液相色譜法和差熱分析法，來(lái)進(jìn)行不同品種及不同加工法的浙貝母質(zhì)量分析。差熱分析時(shí)，不同的升溫速率對(duì)差熱圖譜峰形有影響。

4.2超高效液相色譜法（UPLC）

超高效液相色譜借助HPLC的理論及原理，是分離科學(xué)的一個(gè)全新類(lèi)別。超高效液相色譜作為一個(gè)新興領(lǐng)域，目前已經(jīng)開(kāi)始投入液相實(shí)驗(yàn)中。董林毅采用Water Acquit BEH C18色譜柱（2.lmmlOOxmm，1.7μm），流動(dòng)相為乙腈一甲酸一水體系梯度洗脫，流速為0.4ml/min，PDA檢測(cè)190-400nm掃描；進(jìn)樣量為2.Oμl。6種成分在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性。γ均大于0.996，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好。

5 結(jié)論

貝母甲素含量的測(cè)定研究很多，液相色譜法重復(fù)性好，可用于含貝母甲素的制劑的含量測(cè)定及質(zhì)量控制；隨后是高效液相色譜的普及使用，專(zhuān)屬性強(qiáng)，線性關(guān)系良好，操作簡(jiǎn)便；其中蒸發(fā)光散射器靈敏度高，所受干擾因素少，現(xiàn)在多用此法來(lái)評(píng)價(jià)貝母甲素的質(zhì)量。隨著色譜技術(shù)不斷創(chuàng)新，在高效液相色譜的基礎(chǔ)上涌現(xiàn)出超高效液相色譜和高分離度快速液相色譜，大大提高了分析速率，縮短了分析時(shí)間，開(kāi)始逐漸應(yīng)用于貝母甲素的含量測(cè)定。