個體乳酸閾標志的有氧能力可訓練性相關的尿游離miRNA表達譜特征分析

許英櫻 李巖 徐思

摘 要：miRNA參與調控運動性適應基本生理過程的基因選擇性表達，其調控模式影響適應能力，導致運動能力可訓練性的個體差異。尿游離miRNA（UCFmiRNA）表達譜與組織miRNA密切相關，但不清楚其與運動能力可訓練性的具體關聯，因而無法用于運動員選材和個性化訓練。依據UCFmiRNA表達譜特征與有氧運動能力可訓練性水平的關系，構建關聯模型用于運動員選材和訓練。采用kmeans法對76名男性足球隊員14周有氧訓練前后個體乳酸閾（ILT）變化率做聚類分析，將研究對象分為對訓練的高敏感型組（HR組）和普通敏感型組（CR組）。提取和分析HR組UCFmiRNAs表達譜及模式特征。結果發現：11個在功能上與運動性適應調控相關的UCFmiRNAs構成的特異性表達差異譜與顯著高于平均水平的ILT提高率表型有關聯，其模式特征與良性運動性適應的生理反應特征一致。得出結論：運動性適應UCFmiRNAs特征性表達譜模式與有氧運動能力的可訓練性存在關聯并反映其適應生理特點及狀態，可用來早期預測有氧運動能力發展潛力、評價訓練效果/競技狀態和早期診斷運動傷病。

關鍵詞： 個體乳酸閾；有氧運動能力；尿游離miRNA；可訓練性；關聯模型；運動性適應；運動員選材；個體化訓練

中圖分類號： G 811.31 文章編號：1009783X（2015）02017807 文獻標志碼： A

Abstract：Objective：miRNAs affect the trainability of athletic ability by regulating the essential processes of exercise adaption.The expression profile of Urine cellfree miRNAs （UCFmiRNAs） associates with the pattern of miRNA in tissue，but the specific relation between this profile and the trainability of aerobic athletic ability is unknown.This paper seeks to build the model of UCFmiRNA expressing pattern reflecting the trainability of aerobic athletic ability.Method：76 male soccer athletes are engaged in a 14week aerobic training，and the Individual Lactate Threshold （ILT） before and after the training are measured，and then these athletes are grouped as High Response group （HR group） and Common Response group （CR group），depending on the result of the Kmeans clustering of growth ratio of ILT.The characters of UCFmiRNAs Differential Expression Profile are extracted and analyzed.Result：11 UCFmiRNAs，which are known as closely relating to exercise adoption，and their expressing pattern are extracted，validated，and confirmed to constitute the differential expression profile of HR group which is characteristic of higher growth ratio of ILT，and which Differential Expression Profile coincide with the positive characters of exercise adaption.Conclusion：UCFmiRNAs Differential Expression Profile is closely related to the trainability of aerobic athletic ability，which can be used as a method to forecast the potential of aerobic athletic ability，to value the effect of training，and to diagnose sport hurts early and accurately.

Keywords：individual lactate threshold；aerobic athletic ability；UCFmiRNA；trainability；correlation model；exercise adaption；talent selection；personalized training

杰出的運動能力是具有遺傳優勢的個體在系統水平對長期訓練發生良性適應性重塑的結果[1]。表觀遺傳學基因調控機制在機體響應環境壓力的適應性重塑過程中起到關鍵作用，其基因調控模式具有個體差別并可穩定遺傳，導致適應能力在不同個體間顯著不同[2]。適應能力越強，則運動能力的可訓練性越好，發展潛力越大[3]。目前，對于表觀遺傳學基因調控模式與運動能力訓練敏感性的具體關聯所知甚少，因而無法將其作為指標應用于運動員選材和個性化訓練。

microRNA基因表達調控作用是表觀遺傳學基因調控的主要途徑，是環境因素誘導的基因選擇性表達的主要調控方式[4]。研究表明，microRNAs分子（以下簡稱miRNAs）參與了運動性適應基本生理過程的調控，如肌組織肥大[5]、 血管增生[6]、

收稿日期：20141113

作者簡介：許英櫻（1980—），女，河南洛陽人，碩士，講師，研究方向為體質健康與運動訓練；李巖（1970—），男，山東煙臺人，博士，副教授，研究方向為體質健康與運動訓練；徐思（1971—），男，吉林長春人，博士，副研究員，研究方向為個體發育、疾病發生與藥物治療的表觀遺傳學調控模式。

作者單位：1四川師范大學體育學院，四川成都 610101；2魯東大學體育學院，山東煙臺 264025；3四川省醫學科學院四川省人民醫院，四川成都 610030

1Physical education of Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；2.Physical education of Ludong University，Yantai 264025，China；3.Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial Peoples Hospital，Chengdu 6110030，China.線粒體合成與酶活性提高[7]、心肌/骨骼肌收縮力增強[5]等。miRNAs的表達受轉錄因子系統和表觀遺傳修飾等因素的調控，其調控模式本身存在個體差異，形成個體之間環境因素適應能力的差別。miRNA調控模式差別表現為個體之間的miRNA差異表達譜[8]。近期研究證實，尿液游離miRNA（urine cellfree miRNA，以下簡稱UCFmiRNA）與組織細胞內和循環miRNA表達譜存在密切關聯[9]，尿液游離miRNA來源于：1）泌尿系統細胞內miRNA經外泌體排出；2）循環miRNA經血漿濾過作用進入并穩定存在于尿液中，反映機體整體水平的和泌尿系統特異的適應性基因選擇性表達調控模式，其作為生物標記在臨床早期診斷和判斷疾病預后的價值已經得到證實和應用[10]。因此推測：運動性適應過程中UCFmiRNA特異表達譜可作為反映運動能力的可訓練性的“分子指紋”，在選材階段準確預估運動能力的發展潛力，也可以用來評估訓練效果，作為制訂個性化訓練方案的依據。

有氧耐力水平是決定運動能力的主要因素之一[11]，長期周期性訓練使機體反復不斷地對負荷做出響應和適應，其積累效應為機體適應性重塑和有氧運動能力的提高[12]。個體間表觀遺傳學調控模式差異使每個周期的適應效果產生差別，最終形成表型水平上的顯著個體差異。本研究的設計思路是：以UCFmiRNA作為miRNA調控模式的生物標志，利用一個典型的訓練周期獲取其“靜息—應答—適應”全過程表達譜，分析其與不同訓練敏感水平表型之間的關聯，從而獲得高敏感表型的表觀遺傳學基因表達調控模式特征。個體乳酸閾（Individual Lactate Threshold，以下簡稱ILT）能夠客觀反映具體個體的有氧運動能力[13]，因此，本研究以ILT變化率作為反映有氧運動能力訓練敏感性指標設計實驗：1）未經系統有氧訓練的一組少年男子[年齡為（13.6±0.4）歲]參加為期14周有氧訓練，分別于訓練前后檢測其ILT值，計算ILT的變化率，代表其有氧運動能力的可訓練性水平；2）同一研究對象在訓練前進行大負荷有氧耐力測試，檢測該測試全過程UCFmiRNAs連續表達譜，代表其運動性適應的UCFmiRNA表達譜模式；3）對ILT變化率進行聚類分析，將研究對象分為對訓練的高敏感表型和普通敏感表型，分析高敏感表型個體的運動性適應UCFmiRNA表達譜特征，建立運動性適應cmiRNA表達譜與有氧運動能力可訓練性的關聯模型，作為早期預測有氧運動能力發展潛力和運動性適應特點的指標，用于運動員選材和個性化訓練方案制訂。

四川省某足球學校學員，76名男生，年齡（13.6±0.4）歲，身高（169.20±6.45）cm，體重（59.68±2.93）kg。既往健康，無傷病史，參加試驗前未受過系統的有氧運動能力訓練。

1.2 實驗方案

訓練方案：參加實驗學員進行為期14周的系統性有氧運動能力訓練。每周一、四16：00～17：30進行5 000 m長跑訓練，負荷強度：2～3周60%個人最大心率±3次/min；4～9周65%個人最大心率±3次/min；10～14周75%個人最大心率±3次/min。以Polar表（瑞典產）監控靶心率維持速度（個人最大心率=220-年齡）。訓練方案由教練監督執行。

ILT值檢測：在訓練開始前（第0周）和結束后（第15周）檢測ILT值，分別記為基線值和訓練值。

UCFmiRNAs表達值測定：訓練第1周第1天訓練前清晨空腹安靜狀態下測試UCFmiRNAs基線表達值，第3天完成12 min跑測試后1 h內、恢復24 h和48 h檢測UCFmiRNAs表達值，分別記為測試后0 h表達值、24 h和48 h恢復表達值。具體安排見表1。

1.3 分組和分析方法

1.3.1 計算14周訓練后ILT相對于基線值的變化率

ILT變化率=[（訓練值-基線值）/基線值]×100%

1.3.2 聚類分析和分組

對ILT變化率數值進行kmean聚類分析，根據聚類分析結果將學員分為對有氧運動能力訓練的高敏感型組（high response group，以下簡稱HR組）和普通敏感型組（common response group，以下簡稱CR組）。

1.3.3 HR組UCFmiRNAs特征性表達譜分析

1.3.3.1 獲得UCFmiRNAs表達譜后，參照文獻選取其中與運動性適應相關的miRNAs，qRTPCR驗證并計算各組以下指標：1）基線表達值；2）訓練后0 h表達值；3）24 h恢復表達值；4）48 h恢復表達值相對于基線表達值的變化比率，以相對于基線表達值比率升高或降低超過2倍為顯著性差異表達（基線表達值相對比率為1），以顯著性差異表達的UCFmiRNAs構成有氧運動能力訓練相關UCFmiRNA表達譜。比較HR組和CR組UCFmiRNAs表達譜，提取HR組的UCFmiRNAs特征性表達譜。

1.3.3.2 UCFmiRNA特征性表達譜與ILT關聯模型miRNA入選標準

1）microRNA芯片檢測結果與qRTPCR驗證結果一致。

2）UCFmiRNA的基線表達值在HR組和CR組之間無顯著性差異（±10%以內）。

3）文獻顯示該miRNA與運動性適應相關的生理過程存在關聯。

表 1 實驗測試及訓練安排

1.4 指標檢測方法

1.4.1 ILT測定

采用遞增負荷法測定ILT，功率自行車（瑞典產Monark894E、839E）起始負荷為50 W，每2 min遞增40 W，轉速維持在50 r/min，直至力竭（力竭標準：連續2次不能維持規定轉速），測試過程中鼓勵受試者使其盡可能堅持5個負荷級別。血乳酸值測定：取中指指尖血20 μL，采用YSI1500便攜式血乳酸自動分析儀測定血乳酸值。分別采取安靜狀態下、每級負荷后即刻及恢復期第2、5、8、10、15 min血樣。測試結果記錄在表中，采用Stegmann方法判定ILT[14]。

1.4.2 miRNAs microarray檢測尿液UCFmiRNAs并用qRTPCR驗證

1.4.2.1 miRNAs microarray檢測尿液UCFmiRNAs

尿樣采集和處理：見表1：分別于第1周第1天清晨空腹安靜狀態下、第3天12 min跑測試結束后1 h內、恢復24 h和48 h后安靜狀態接取中段尿100 mL，離心，取上清，凍干法濃縮至25 mL，參照文獻方法[15]，每份樣本加入miRNA422b mimic（終濃度為2×105 mmol/L）作為質控標記。放入-80 ℃冰箱保存，備用。

總RNA提取和MicroRNA芯片測定UmiRNAs表達譜：采用miRCURY RNA isolation kit（EX300112 Exiqon）提取small RNA（2。

1.4.2.2 UCFmiRNA實時定量RTPCR（qRTPCR）

尿液miRNA使用mirVana TM Pairs miRNA isolation kit（Ambion）試劑盒抽提，miRNA的提取參照試劑盒的使用說明書進行。以10 ng總RNA為模板合成cDNA，使用MMLV反轉錄酶試劑盒（Thermo），利用設計合成的特異性反轉錄引物進行反轉錄反應（引物序列見表2），條件為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

BioRad iCycler PCR System進行qRTPCR檢測[Real Master Mix（SYBR Green）等PCR相關產品均購自天根生化科技有限公司]。Real Time PCR反應程序：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40循環；以上循環結束后進行65～95 ℃的融解曲線分析。為確保實驗數據的有效性，每個樣品平行3次，溶解曲線為單一峰（擴增曲線和溶解曲線見圖1）。PCR完成后經電腦分析，查看每個miRNA的擴增情況，導出相應的域值循環數CT值，以U6作為相對定量的內參。目的基因的相對表達 （relative expression，RQ） 采用△△CT方法計算，2△△CT為目的基因的相對表達強度。

表 2 UCFmiRNAs反轉錄引物和qRTPCR檢測引物序列

表 2（續）

圖 1 A為cmiRNAs擴增曲線；B為cmiRNAs熔解曲線

1.5 數據處理與分析

采用SPSS 17.0軟件對結果進行處理。各項數據均采用表示，均數間比較采用兩獨立樣本的t檢驗分析，P<0.05表示2組間的差異有統計學意義。

2 研究結果

2.1 ILT測定結果

參訓學員ILT基線值和訓練值見表3。

表 3 參訓學員14周訓練前后ILT水平（X±S）

2.2 對ILT變化率進行聚類分析結果

kmean法對參訓學員14周訓練后ILT相對于基線值變化百分率進行聚類分析，將實驗對象分為HR組和CR組，聚類結果如圖2所示。聚類中心分別為36%和21%。比較2組間ILT變化率，HR組顯著高于CR組（P<0.05），具體結果見表4。

2.3 HR組UCFmiRNA特征性表達譜

與CR組表達水平相比較，HR組有顯著性差異的UCFmiRNAs有25條，其中上調14條，下調或保持平穩11條。查詢文獻獲得功能與運動性適應有關的miRNAs并經qRTPCR確認表達模式與基因芯片結果一致為11條，其中6條以上調為主要特征，5條以平穩或下調為主要特征。UCRmiRNAs名稱及功能見表5和表6，cmiRNAs表達模式特征分別如圖3（上調）和圖4（下調或保持平穩）所示。圖3中，以靜息狀態cmiRNAs表達水平的相對值為1，HR組與CR組相比較表達模式以顯著上調為主要變化趨勢的miRNAs表達特征如下：1）HR組miR29b、451、222、181、26a表現為訓練后0 h顯著上調，24 h回調至靜息水平，48 h保持平穩。2）CR組miR192在0 h顯著上調，24 h在高水平保持平穩48 h繼續上調；其余miRNAs表達水平均在靜息值左右波動，無顯著性改變。圖4中，以靜息狀態cmiRNAs表達水平的相對值為1，HR組與CR組相比較表達模式以平穩和顯著下調為主要變化趨勢的miRNAs表達特征如下：1）CR組miR133、328、146a表現為訓練后0 h顯著上調，24 h開始回調，48 h繼續回調，趨向平穩；miR155表現為訓練后0 h顯著上調，24 h繼續上調，48 h回調。2）HR組miR133、328、146a表達水平均在靜息值左右波動，無顯著性改變；miR155在24 h顯著下調，48 h小幅回調；miR192在0 h上調，24 h回調，48 h趨向平穩。

圖 2 kmean法對參訓學員14周訓練后ILT

相對于基線值變化百分率聚類分析結果3 討論

本研究探討有氧訓練的運動性適應過程中UCFmiRNA表達譜與有氧運動能力可訓練性之間的關聯。研究發現，具有顯著高于普通水平的ILT變化率表型的個體在運動性適應過程中有11個UCFmiRNA顯示出明顯特征性的表達模式。文獻表明，該組UCFmiRNA參與調控運動性適應的基本生理過程。本研究結果表明，一組特定的UCFmiRNA的特征性表達譜與有氧運動能力的可訓練性水平具有顯著的關聯性，可用來建立關聯模型對其加以鑒別和評估。本研究結果提示，運動性適應能力與miRNA調控基因選擇性表達的模式有關，杰出運動能力表型的可訓練性水平可以通過特征性UCFmiRNA表達譜加以分辨和評估?？梢岳锰卣餍缘腢CFmiRNA表達譜在有氧能力發展敏感期準確預測其發展潛力，在早期將具有相關運動天賦的運動員選拔出來加以系統培養，或用以評估運動員的訓練適應狀態，調整訓練計劃，預防和早期診斷運動傷病。

遺傳因素決定了個體運動能力的上限及其訓練敏感性，但迄今為止還沒有發現經典遺傳學意義上決定運動能力的主控基因；因此仍不清楚是什么遺傳因素決定了具體個體的運動能力及其訓練敏感性，而如何早期準確預測和評估個體運動能力的發展潛力仍然是運動選材和訓練的基本問題[24]。機體在訓練壓力的適應過程中發生基因選擇性表達，表觀遺傳學調控機制決定了基因表達的選擇性和表達效率，通過DNA甲基化、組蛋白共價修飾、RNA編輯等機制對環境因素做出響應和適應，miRNAs編輯作用是表觀遺傳學基因調控的重要途徑，可能是運動能力及其訓練敏感性個體差異主要原因。近期研究證實，miRNAs在運動適應性應答過程中發揮了重要調控作用[25]。miRNAs的表達受表觀遺傳學控制，使基因調控方式本身存在類型差別，影響個體訓練敏感性和運動能力的發展潛力[26]。miRNA調控模式反映在其表達譜上，并與UCFmiRNA存在密切關聯[10]，通過檢測UCFmiRNAs表達譜鑒別miRNA基因調控模式，使研究者有可能在運動員選材和訓練中準確預測和評估運動員對訓練負荷的適應能力。本研究在以下方面對UCFmiRNA在運動訓練中的應用進行了新的探索：1）本研究首次以尿液UCFmiRNA表達譜作為生物標記鑒別與分析有氧運動能力可訓練性的表觀遺傳學調控模式。尿液內UCFmiRNA與細胞miRNA和游離miRNA表達譜存在密切關聯，作為病理學生物標記已經應用于臨床疾病診斷和預后。大強度運動后腎臟濾過機能改變使尿UCFmiRNA在成分和表達水平上與循環miRNA接近，同時，泌尿系統組織特異性的miRNA表達譜也會隨機體生理病理狀態變化而發生改變，因而可以作為反映運動性適應過程中miRNA調控模式類型和適應狀態的生物標記。2）本研究建立了UCFmiRNA與有氧能力訓練敏感性的關聯模型和一種簡便易行的無創檢測方案，可以用于早期評估有氧運動能力的發展潛力和訓練適應狀態。

關于UCFmiRNA的表達行為機理及其與組織miRNA和循環miRNA的確切關系，目前尚不清楚，因此，對于運動性適應的miRNA基因調控機理探討超出了本研究范圍；但在此仍可以對于UCFmiRNA表達特征所反映的運動性適應狀態做一定的分析。首先，運動后即刻（0 h）腎臟濾過功能減弱，此時的UCFmiRNA表達譜與循環miRNA表達譜十分接近，因此可以通過其0 h表達譜分析訓練誘導的運動性適應機理和miRNA調控模式特征。運動性適應過程中，miRNAs調控基因選擇性表達，其作用機理是通過與靶基因mRNA3UTR結合促進其降解或抑制翻譯引起衰減效應，此外，還通過翻譯起始抑制，翻譯起始后抑制，P小體（processing body）、應激顆粒（stress granule）扣押靶mRNA、去抑制和激活等作用調節基因選擇性表達[27]。體能訓練的實質是運動應激，誘導機體做出響應。在訓練過程中，血液重新分布引起局部缺氧和代謝物堆積，血液循環速度加快引起紅細胞機械損傷，心肺系統工作負荷增加導致心肌、骨骼肌、血管/呼吸道管腔壁機械應力增加，能量快速消耗引起代謝系統工作狀態改變，代謝加速導致自由基水平迅速上升，增加氧化應激損害，持續性大強度運動引起疲勞和免疫機能抑制等。miRNAs調控基因選擇性表達使機體發生肌組織肥大、血管增生、線粒體合成與酶活性提高、心肌/骨骼肌收縮力增強等適應性表型[27]。分析0 h UCFmiRNAs表達譜特征可見：1）與CR組相比，HR組在以下適應性反應方面具有更強的調控反應：①心肌、骨骼肌、血管/呼吸道管腔壁平滑肌對應力變化的響應，以及肌組織肥大、彈性增強和肌纖維類型轉換（miR21[18]、miR451[17]、miR181[19]、miR26a[20]、miR222[15]）；②線粒體代謝能力增強（miR181[19]）；③心肌、骨骼肌對胰島素的敏感性增強，糖代謝水平提高（miR29b[16]）；④促紅細胞生成作用（miR451[17]）。同時，肌肉特異性miRNA（miR133[21]）水平保持穩定，說明HR組未出現明顯的肌損傷；miR146a[15]平穩、miR155[22]下調表明HR組未出現運動性免疫抑制，表明其疲勞耐受能力強。2）從UCFmiRNA表達譜整體特征可以看出，在24 h到48 h，各個UCFmiRNA均恢復至靜息水平，表明HR組腎臟功能狀態恢復顯著好于CR組，反映出HR組對于運動性疲勞具有更好的耐受性和更強的恢復能力。3）miR192[23]是腎組織特異表達的miRNA，與腎功能和尿蛋白水平平行的相關性[28]，而尿蛋白水平與運動性疲勞耐受及恢復關系密切[29]。與CR組比較，HR組miR192表達水平更快地恢復到靜息狀態并保持穩定，表明其腎臟功能迅速恢復正常水平，因此可以推斷HR組對疲勞耐受力更強、恢復更快、適應狀態更好。盡管目前還不了解UCFmiRNAs的表達水平變化在運動性適應過程中的確切含義，但根據已有研究對miRNA功能的認識，HR組UCFmiRNAs特征表達譜顯示的運動性適應有關的代謝調控特征符合研究者對優秀運動員的訓練適應特點的經驗性了解。說明UCFmiRNA表達特征與運動性適應之間存在本質上的一致性。

本研究的發現為miRNAs在運動訓練領域的進一步深入研究提供了重要的依據。首先，miRNAs是18～22 nt的短鏈分子，主要作用機理是通過與靶基因mRNA 3UTR結合調節其表達效率。目前已知的很多與運動能力表型相關的基因多態性突變均發生于3段序列，單個堿基的突變就可以明顯影響miRNAs與靶基因的結合效率；因此，miRNAs很有可能是基因多態性影響運動表型的重要調控途徑之一，進一步的研究將以此為線索展開。其次，UCFmiRNAs是一種無創檢測的表觀遺傳學基因調控方式，其表達特征與適應過程的基本環節密切關聯，反映了機體對運動訓練的適應能力，與遠期訓練效果有著密切關聯，因而可以作為生物標記應用于運動員選材。第三，UCFmiRNAs反映了機體對負荷的適應狀態、耐受程度、疲勞程度及恢復情況，因而可以作為監控指標應用于運動訓練。最后，UCFmiRNAs表達特征與運動傷病存在直接的關聯，可以作為早期診斷指標應用于運動傷病的診斷和治療。

本研究的局限：1）本研究在研究對象的性別、數量、所處的敏感期、訓練方式和運動水平等方面都存在局限性，所以，盡管本研究對UCFmiRNAs表達特征與有氧能力關聯的可訓練性做出了一定程度的說明；但所得到的UCFmiRNAs表達譜對與運動員選材和訓練的應用價值還需要進一步的驗證和補充。2）尿液中游離miRNA含量較低，直接采用miRNAarray不易檢測，濃縮方法雖然不影響miRNA的穩定性；但對分析結果的干擾仍需進一步研究，同時在檢測方法學上仍需作進一步的論證方可大范圍應用于運動訓練實踐工作。3）UCFmiRNAs表達譜在運動型適應過程中的確切含義及其與組織miRNA和其他體液miRNA表達譜之間的關聯關系仍有待深入研究，目前無法對結果進行深入的功能性解讀，本研究結果目前只能停留在生物標記應用水平。

4 結論

綜上所述，本研究發現典型有氧訓練周期的運動性適應過程中UCFmiRNAs表達譜與有氧運動能力的可訓練性之間存在密切的聯系，并初步建立關聯模型，同時也提出一種采用表觀遺傳學指標進行運動員選材和指導訓練的方法，以UCFmiRNAs表達特征作為生物標記評估運動能力的發展潛力和訓練適應狀態。進一步的研究將對UCFmiRNAs特征表達譜在運動員選材、訓練效果/比賽狀態評估以及運動傷病的診斷治療等方面的應用價值做出更為全面和深入的探索。

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