跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)及海馬CA1、CA3 區(qū)NGF表達(dá)的影響

于芳 崔建梅 薄媛媛 張安民

摘 要：為觀察4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（CUS）致抑郁大鼠行為學(xué)、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及皮質(zhì)醇（CORT）含量、海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)的影響，將30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、應(yīng)激模型組及應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組，大鼠建立慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激抑郁模型，同時(shí)應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)及應(yīng)激結(jié)束后通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)方法評(píng)定大鼠行為學(xué)指標(biāo)變化情況，采用八臂迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使用放射免疫法測(cè)試大鼠血漿ACTH及CORT含量，采用免疫組織化學(xué)結(jié)合圖像半定量方法對(duì)海馬CA1、CA3區(qū)NGF神經(jīng)元的數(shù)量及面積進(jìn)行測(cè)量和分析。結(jié)果顯示： 1）與應(yīng)激模型組相比，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠穿越格數(shù)、直立次數(shù)及修飾次數(shù)均顯著增加（P<0.01，P<0.05，P<0.05），中央格停留時(shí)間顯著縮短（P<0.05），懸尾不動(dòng)時(shí)間縮短（P<0.05）；2）與應(yīng)激模型組相比，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著縮短（P<0.05），RME及TE均顯著減少（P<0.05，P<0.05）；3）與應(yīng)激模型組相比，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠血漿ACTH及CORT含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）；4）與應(yīng)激模型組相比，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增加（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。得出結(jié)論：跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可改善抑郁模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，機(jī)理可能與長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)降低抑郁大鼠的血漿ACTH及CORT水平、拮抗HPA軸功能亢進(jìn)及增強(qiáng)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)NGF的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；抑郁模型；學(xué)習(xí)記憶；海馬；神經(jīng)生長(zhǎng)因子

中圖分類(lèi)號(hào)： G 804.7 文章編號(hào)：1009783X（2015）01018507 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Abstract：Objetive：To explore the effects of the 4week treadmill exercise on the behavior，the blood plasma ACTH and CORT content and NGF expression in the CA1 and CA3 of hippocampus in the depressive rats induced by Chronic Unpredictable Stress （CUS）.Methods：30 male SD rats are randomly allocated to control group （C），stress model group （SM） and stress exercise group （SE）.The model of chronic unpredictable stress for all rats is established and rats from control group are given 4week treadmill exercise at the same time.The behavioral changes are conducted by open field test （OFT），tail suspension test （TST）；then all rats are submitted to behavioral testing for spatial memory by the eightradial arm maze test，blood plasma ACTH and CORT contents are tested by radioimmunoassay；applied immunohistochemical and image semiquantitative methods to measure and analyze the number，area of NGF neurons of CA1 and CA3 zone of Hippocampus are detected and analyzed by using immuneohistochemical method and semiquantitative.Results：1） as compared with the rats in the stress model group，the rats in the stress exercise group have a significantly increased number of squares crossed，number of times of standing up，number of times of decoration （P<0.01，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P Keywords：treadmill exercise；depressive model；learning and memory；hippocampus；NGF

收稿日期：20140318

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（20110110341）。

作者簡(jiǎn)介：于芳（1968—），女，山西太原人，碩士，教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)；崔建梅（1972—），女，河北石家莊人，碩士，講師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與中醫(yī)康復(fù)；張安民（1959—），男，山西萬(wàn)榮人，學(xué)士，教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)。

作者單位：1中北大學(xué)體育學(xué)院，山西太原 030051；2山西財(cái)經(jīng)大學(xué) 體育學(xué)院，山西 太原 030006

1School of Sport and Physical Education，North University of China，Taiyuan 030051，China；2Institute of Physical Education，Shanxi University of Finance and Economics，Taiyuan 030006，China. 抑郁癥（depression）是一類(lèi)常見(jiàn)的以長(zhǎng)期持續(xù)性情緒低下為主的心境障礙性疾病，呈慢性、反復(fù)發(fā)作，以顯著而持久的情緒低落、活動(dòng)能力減退、思維與認(rèn)知功能遲緩為主要表現(xiàn)，是嚴(yán)重危害人類(lèi)身心健康的常見(jiàn)病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球超過(guò)1億2 100萬(wàn)人患有抑郁癥，從人類(lèi)抑郁癥發(fā)病的原因來(lái)看，應(yīng)激性生活事件是抑郁癥的明顯促發(fā)因素。慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（chronic unpredictable stress，CUS）是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的抑郁動(dòng)物模型之一，它可模擬抑郁的核心癥狀——快感缺乏及行為絕望，目前被廣泛運(yùn)用于抑郁癥的病理生理機(jī)制、抗抑郁藥物研發(fā)及作用機(jī)制研究。學(xué)習(xí)記憶能力降低是抑郁癥狀的重要表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)表明一定程度的應(yīng)激可以引起大鼠及人類(lèi)學(xué)習(xí)記憶能力的減退[12]。許多學(xué)者研究認(rèn)為，長(zhǎng)期有氧鍛煉可以改善人類(lèi)情緒障礙及認(rèn)知功能的缺陷，Clark等[3]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)鍛煉能降低應(yīng)激導(dǎo)致的嚙齒動(dòng)物的焦慮行為，改善動(dòng)物的認(rèn)知功能，然而機(jī)制尚不清楚。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與應(yīng)激關(guān)系密切的腦區(qū)主要有海馬、杏仁核、下丘腦、前額葉皮層及紋狀體等部位。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是學(xué)習(xí)記憶和情緒整合的神經(jīng)中樞，其結(jié)構(gòu)損傷可能是抑郁癥患者情緒低落和學(xué)習(xí)記憶能力下降的基礎(chǔ)[4]。依據(jù)細(xì)胞形態(tài)、不同皮質(zhì)區(qū)發(fā)育的差異以及纖維排列的不同可將海馬劃分為4個(gè)不同區(qū)域CAl、CA2、CA3和DG區(qū)，不同區(qū)域的功能不盡相同，研究認(rèn)為慢性應(yīng)激引起大鼠抑郁樣行為與海馬CA1、CA3區(qū)的形態(tài)學(xué)改變有關(guān)[5]，而且海馬Cal、CA3區(qū)在動(dòng)物的信息處理及空間記憶方面承擔(dān)著較為重要的作用[6]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，廣泛地分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)皮質(zhì)、海馬和基底前腦的膽堿能神經(jīng)元有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)神經(jīng)元的可塑性及其形成和生存起重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)NGF在抑郁癥的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，與應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁樣行為及神經(jīng)形成減少有關(guān)[78]；因此，本實(shí)驗(yàn)以海馬CA1、CA3區(qū)為研究重點(diǎn)，通過(guò)復(fù)制CUS大鼠模型觀察跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周后大鼠抑郁行為（探索行為及絕望行為）及空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變和海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)的變化，探討跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善抑郁模型大鼠抑郁行為及學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

雄性成年SD大鼠體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度（55±10）%，12 h晝夜節(jié)律（光照時(shí)間07：00—19：00），自由飲食。適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機(jī)分為3組：1）正常對(duì)照組（C）；2）應(yīng)激模型組（SM）；3）應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組（SE）。每組10只。應(yīng)激模型組及應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠單獨(dú)分籠喂養(yǎng)。

1.2 慢性應(yīng)激抑郁模型的制備

慢性不可預(yù)知應(yīng)激抑郁動(dòng)物模型參照Willner的方法[9]，造模方法如下：禁水（24 h）、懸尾（5 min）、束縛（2 h）、4 ℃冷水強(qiáng)迫游泳（5 min）、禁食（24 h）、45 ℃環(huán)境（5 min）、晝夜顛倒（24 h）、20 min電擊足底（0.8 A，每次持續(xù)4 s、間隔5 min），每天給予1次刺激，刺激隨機(jī)安排到4周內(nèi)，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免發(fā)生適應(yīng)性。

1.3 跑臺(tái)訓(xùn)練方案

1）應(yīng)激模型組大鼠從第2周開(kāi)始接受為期4周的CUS程序。2）應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組：跑臺(tái)訓(xùn)練前大鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練，正式訓(xùn)練時(shí)，每天下午進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，大鼠0坡度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周，第1～2周大鼠每天運(yùn)動(dòng)30 min（10 m/min×3），第3周每天運(yùn)動(dòng)45 min（15 m/min×3），第4周每天運(yùn)動(dòng)60 min（15 m/min×4），跑臺(tái)訓(xùn)練期間每個(gè)程序之間大鼠休息5 min。跑臺(tái)訓(xùn)練時(shí)不使用電擊裝置驅(qū)趕大鼠，以避免對(duì)大鼠施加不良應(yīng)激，同時(shí)每天上午接受1次CUMS程序，為期4周。3）正常對(duì)照組：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常對(duì)照組大鼠除了必要的例行鼠籠清潔，不做任何干擾[10]。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

慢性應(yīng)激及跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束后第2天，所有大鼠進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估大鼠的一般運(yùn)動(dòng)能力及探索行為。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱大小為100 cm×100 cm×50 cm，底面用黑線分為面積相等的25個(gè)方格（20 cm×20 cm）。每只大鼠放在實(shí)驗(yàn)箱中央讓自由探索5 min，實(shí)驗(yàn)箱正上方裝有一個(gè)攝像頭監(jiān)視大鼠在箱內(nèi)的活動(dòng)，主要觀察中央格停留時(shí)間、穿越格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)及糞便顆粒。每次實(shí)驗(yàn)后將糞便清除干凈。

1.5 懸尾實(shí)驗(yàn)

參見(jiàn)Stem等報(bào)道的方法[11]，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，將大鼠尾巴距尾尖部約l cm處用膠布貼于懸尾箱（30 cm×30 cm×25 cm）支架上，使大鼠成倒掛狀態(tài)，其頭部離箱底約5 cm，一次懸掛2只大鼠，中間用隔板隔開(kāi)。懸掛時(shí)間為6 min，統(tǒng)計(jì)大鼠后4 min內(nèi)懸尾累積不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)狀態(tài)即大鼠停止掙扎不動(dòng)或無(wú)任何活動(dòng)）。

1.6 八臂迷宮實(shí)驗(yàn)程序

懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，所有大鼠進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前大鼠先在迷宮中適應(yīng)2 d，每天2次。適應(yīng)時(shí)，迷宮各臂及中央?yún)^(qū)分撒食物顆粒，然后同時(shí)將4只大鼠同時(shí)置于迷宮中，讓其自由攝食、探究10 min，適應(yīng)迷宮環(huán)境。正式訓(xùn)練時(shí)，將食物放在其中的四臂（分別為1、3、5、7號(hào)臂）。大鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)，此時(shí)中央?yún)^(qū)四周用鼠門(mén)關(guān)住，15 s后將門(mén)打開(kāi)并開(kāi)啟分析測(cè)試軟件。大鼠可自由選擇進(jìn)入放射狀臂覓食，直至10 min末或提前吃完四臂食物，即結(jié)束一次訓(xùn)練。測(cè)試指標(biāo)：1）完成八臂迷宮的時(shí)間（TT）；2）工作記憶錯(cuò)誤（WME），重新進(jìn)入放食物臂或第1次進(jìn)入放食物臂而不攝取食物；3）參考記憶錯(cuò)誤（RME），進(jìn)入不放食物臂；4）總記憶錯(cuò)誤（TE），工作記憶錯(cuò)誤與參考記憶錯(cuò)誤之和。

1.7 大鼠海馬CA1、CA3 區(qū)NGF測(cè)試

八臂迷宮行為測(cè)試結(jié)束后即刻，每組大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，開(kāi)胸（同時(shí)心臟取血2 mL測(cè)血漿ACTH及cort含量），經(jīng)常規(guī)灌注固定，石蠟包埋后常規(guī)腦組織切片，片厚5 μm，進(jìn)行NGF免疫組織化學(xué)染色（免疫組化檢測(cè)試劑盒為武漢博士德公司生產(chǎn)）。將石蠟切片置于65 ℃烤箱中烤片1 h，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，入3%H2O2-甲醇液，室溫孵育30 min，然后加入NGF 血清第一抗體（兔IgG，37 ℃孵育1 h），0.1 molPBS洗2 min×3，隨后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體37 ℃孵育1 h；接著入ABC液，37 ℃孵育1 h，DAB呈色、蘇木素輕度復(fù)染、裱片、脫水、透明、封片。

1.8 各組大鼠血漿ACTH及CORT含量測(cè)試

各組大鼠心臟取血（取血測(cè)血漿ACTH、CORT含量），每只采血量1.0 mL，放入加有肝素鈉的試管，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分離血漿，平均分放在2個(gè)EP管，貼好標(biāo)簽，儲(chǔ)藏在溫度為-20 ℃冰箱用于ACTH及CORT含量測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.9 圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定大鼠海馬CA1、CA3的位置（1AB），用數(shù)碼顯微鏡拍片，江蘇捷達(dá)形態(tài)學(xué)分析軟件對(duì)大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)NGF陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及面積（400倍）。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用X±S表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVE）對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極顯著差異。

圖 1 AB 冠狀位下海馬CA1、CA3區(qū)NGF截面圖（箭頭所示）

2 研究結(jié)果

2.1 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，應(yīng)激模型組大鼠中央格停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.01），穿越格數(shù)、直立次數(shù)及修飾次數(shù)均顯著減少（P<0.01，P<0.01，P<0.01），糞便顆粒增加（P<0.05），懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.01）；經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，與應(yīng)激模型組比較，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠穿越格數(shù)、直立次數(shù)及修飾次數(shù)均顯著增加（P<0.01，P<0.05，P<0.05），糞便顆粒與應(yīng)激模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中央格停留時(shí)間和懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P<0.05，P<0.05）。

表 1 各組大鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果一覽表（X±S，n=10）

注：## P<0.01，#P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，*P<0.05，與應(yīng)激模型組比較。

2.2 大鼠八臂迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

表2結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，應(yīng)激模型組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.01），工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)（WME）及參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)（RME）均顯著增多（P<0.01，P<0.05），總記憶錯(cuò)誤次數(shù)（TE）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組（P<0.01）；與應(yīng)激模型組比較，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著縮短（P<0.05），RME及TE均顯著減少（P<0.05，P<0.05），WME與應(yīng)激模型組大鼠比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 2 各組大鼠八臂迷宮測(cè)試結(jié)果一覽表（X±S，n=10）

注：##P<0.01，#P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，*P<0.05，與應(yīng)激模型組比較。

2.3 各組大鼠血漿ACTH、Cort結(jié)果

如表3所示，與正常對(duì)照組比較，應(yīng)激模型組大鼠血漿ACTH及CORT含量均顯著增加（P<0.01，P<0.01），增加幅度為88%及97%；經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠血漿ACTH及CORT含量降低（P<0.05，P<0.01），下降幅度分別為23%及27%，提示長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)拮抗慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的HPA軸功能亢進(jìn)，從而達(dá)到抗抑郁目的。

表 3 各組大鼠血漿ACTH及Cort結(jié)果一覽表（X±S，n=10）

注：##P<0.01，#P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，*P<0.05，與應(yīng)激模型組比較。

2.4 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)結(jié)果

海馬CA1、CA3區(qū)內(nèi)分布有大量NGF，胞漿染色，胞核不染色，形態(tài)規(guī)則，且排列密集，胞體形態(tài)多種多樣呈圓形或橢圓形，如圖2、圖3所示。由表4可知：與正常對(duì)照組比較，應(yīng)激模型組大鼠海馬CA1區(qū)NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著減少（P<0.01，P<0.01）；經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬CA1區(qū)NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增加（P<0.05，P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，應(yīng)激模型組大鼠海馬CA3區(qū)NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著減少（P<0.01，P<0.01）；經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠海馬CA3區(qū)NGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增加（P<0.05，P<0.05）。

表 4 各組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF神經(jīng)元圖像分析結(jié)果（X±S，n=10）

注：##P<0.01，#P<0.05，與對(duì)照組比較；**P<0.01，*P<0.05，與應(yīng)激模型組比較。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示應(yīng)激模型組大鼠海馬CA1區(qū) NGF免疫陽(yáng)性神經(jīng)元（→）表達(dá)減弱；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周后大鼠NGF免疫陽(yáng)性神經(jīng)元（→）表達(dá)增強(qiáng)。A：對(duì)照組；B：應(yīng)激模型組；C：應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組。

圖 2 AC：海馬CA1區(qū)NGF陽(yáng)性神經(jīng)元分布

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示應(yīng)激模型組大鼠海馬CA3區(qū)NGF免疫陽(yáng)性神經(jīng)元（→）數(shù)量及面積均顯著減少；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周后大鼠NGF免疫陽(yáng)性神經(jīng)元（→）數(shù)量及面積均顯著增加。A：對(duì)照組；B：應(yīng)激模型組；C：應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組。

圖 3 AC：海馬CA3區(qū)NGF陽(yáng)性神經(jīng)元分布

3 討論

3.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)抑郁模型大鼠抑郁行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響

慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激抑郁模型與人類(lèi)抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源促進(jìn)疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機(jī)理接近。由于抑郁癥涉及情緒、行為和軀體方面的功能紊亂，是一種“全身性”的疾病；因此，應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)測(cè)性是模型制造成功的關(guān)鍵[12]。本研究所涉及的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中，懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的是動(dòng)物的“絕望”情緒，其原理是利用動(dòng)物懸尾后企圖逃脫但又無(wú)法逃脫，從而放棄掙扎，進(jìn)入特有的抑郁不動(dòng)狀態(tài)，以一定時(shí)間內(nèi)動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間來(lái)反映其“絕望”情緒，這種行為絕望與抑郁癥類(lèi)似[13]。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠停止掙扎、處于不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間延長(zhǎng)，反映了大鼠悲觀、絕望程度增加。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)用動(dòng)物行為指標(biāo)檢測(cè)類(lèi)似于人的復(fù)雜情緒如焦慮、抑郁等的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，可檢測(cè)動(dòng)物的自發(fā)行為和探究行為，可用來(lái)測(cè)試動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“興奮”或“抑郁”狀態(tài)[14]。水平穿越格數(shù)及直立次數(shù)表示大鼠的探究行為，中央格停留時(shí)間表示大鼠啟動(dòng)活動(dòng)的潛伏期及大鼠進(jìn)入一個(gè)陌生環(huán)境后對(duì)新環(huán)境的好奇程度，停留時(shí)間越長(zhǎng)越能反映大鼠對(duì)新環(huán)境的淡漠心理，理毛時(shí)間反映大鼠對(duì)周?chē)h(huán)境的警覺(jué)性及對(duì)自身的關(guān)注，排便量反映大鼠的緊張恐懼狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)激模型組大鼠穿越格數(shù)、直立次數(shù)及修飾詞數(shù)均顯著減少，中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)，糞便顆粒增加，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中大鼠停止掙扎、處于不動(dòng)狀態(tài)的時(shí)間延長(zhǎng)。這些行為表明正常大鼠在各種應(yīng)激因子慢性刺激作用下，大鼠活動(dòng)及探究能力降低，對(duì)新鮮環(huán)境的好奇程度下降，興趣喪失，大鼠悲觀及絕望程度增加，提示本實(shí)驗(yàn)中大鼠抑郁模型的復(fù)制是成功的。

八臂迷宮已被公認(rèn)為一種比較理想的評(píng)估嚙齒動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的模型，該模型已被廣泛接受和應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，學(xué)習(xí)記憶能力降低是抑郁癥狀的重要表現(xiàn)[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)八臂迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組比較，應(yīng)激模型大鼠完成八臂迷宮時(shí)間顯著延長(zhǎng)，參考記憶、工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)及總錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，這與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致[16]。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可以改善抑郁病人的情緒低落及認(rèn)知功能的下降情況，而且運(yùn)動(dòng)作為1種預(yù)防抑郁病人復(fù)發(fā)的治療方法，其效果優(yōu)于抗抑郁藥[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者設(shè)計(jì)的抑郁模型大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)為4周，而且本研究也證實(shí)，經(jīng)過(guò)4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，曠場(chǎng)試驗(yàn)中應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠的活動(dòng)度增加、對(duì)新環(huán)境的好奇程度增強(qiáng)，懸尾實(shí)驗(yàn)中，大鼠不動(dòng)時(shí)間縮短，八臂迷宮實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠完成八臂迷宮時(shí)間縮短、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)及總錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少、學(xué)習(xí)記憶能力明顯增強(qiáng)，提示長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以在一定程度上改善抑郁模型大鼠對(duì)新環(huán)境的好奇程度減弱情況并能對(duì)抗抑郁大鼠的絕望行為，增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，具有抗抑郁作用。

3.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)抑郁模型大鼠血漿ACTH及CORT含量的影響

應(yīng)激可使機(jī)體出現(xiàn)抑郁、學(xué)習(xí)記憶障礙、應(yīng)激性精神紊亂等多種疾患，而這些疾患的發(fā)生及嚴(yán)重程度與下丘腦垂體腎上腺軸（HPA）持續(xù)亢進(jìn)密切相關(guān)[18]。HPA軸作為大腦應(yīng)激應(yīng)答的重要機(jī)制之一，在抑郁癥的病因、病理學(xué)機(jī)制中起關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，下丘腦室旁核（PVN）小細(xì)胞神經(jīng)元分泌包括CRH在內(nèi)的多種促進(jìn)ACTH分泌的激素，進(jìn)而刺激垂體分泌ACTH，ACTH經(jīng)血循環(huán)達(dá)腎上腺，促使糖皮質(zhì)激素分泌增多，過(guò)量的糖皮質(zhì)激素能導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)抑郁癥狀[19]。CORT是HPA軸的重要激素，對(duì)恐懼和焦慮情緒作用明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，高糖皮質(zhì)醇血癥時(shí)，海馬神經(jīng)元將受損[20]，而對(duì)抑郁癥患者死亡后的大腦組織進(jìn)行尸檢，也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。海馬是HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，海馬內(nèi)含有較高密度的糖皮質(zhì)激素受體，長(zhǎng)期過(guò)量的糖皮質(zhì)血癥使海馬神經(jīng)元萎縮死亡，而海馬神經(jīng)元的損害將打斷了正常應(yīng)激反應(yīng)時(shí)海馬對(duì)HPA軸的抑制作用而形成惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果，經(jīng)過(guò)4周慢性不可預(yù)知應(yīng)激大鼠血漿ACTH及CORT水平較正常對(duì)照組相比均顯著增加，增幅分別達(dá)到88%及97%，說(shuō)明慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁大鼠HPA軸功能紊亂。可能的原因如下：HPA軸自身具有分泌激素的功能，在應(yīng)激過(guò)程中HPA軸所涉及的激素CRH、ACTH和CORT相互作用構(gòu)成1個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。慢性應(yīng)激使機(jī)體負(fù)反饋抑制效應(yīng)減弱，從而出現(xiàn)ACTH及CORT的分泌高峰，導(dǎo)致HPA軸功能的亢進(jìn)，引起機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌等多系統(tǒng)的功能紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)抑郁癥的各種癥狀[21]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可通過(guò)拮抗HPA軸功能亢進(jìn)改善抑郁大鼠的抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力的下降[22]。本研究也證實(shí)了此觀點(diǎn)，4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以減少慢性應(yīng)激致抑郁大鼠ACTH及CORT的過(guò)度分泌，行為學(xué)測(cè)試表現(xiàn)為慢性應(yīng)激大鼠的活動(dòng)度增加，大鼠對(duì)新環(huán)境的好奇程度增強(qiáng)，絕望程度改善，慢性應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，從而提示運(yùn)動(dòng)能夠有效地改善慢性應(yīng)激大鼠的抑郁狀態(tài)，阻斷應(yīng)激對(duì)HPA軸的刺激作用及維持HPA軸的穩(wěn)定。提示運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷進(jìn)行修復(fù)，從而對(duì)HPA軸起到作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.3 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)抑郁模型大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)的影響

抑郁癥的病理機(jī)制目前尚不完全清楚，但海馬腦區(qū)損傷這一點(diǎn)已得到大家普遍認(rèn)同。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，參與情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起到關(guān)鍵作用[23]。研究顯示，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致海馬出現(xiàn)體積減小、細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞萎縮及增生抑制等多種神經(jīng)元可塑性受損的表現(xiàn)，同時(shí)伴有學(xué)習(xí)、記憶和情緒反應(yīng)的缺陷[24]。海馬CA3區(qū)是一個(gè)對(duì)應(yīng)激極度敏感的亞區(qū)，從病理上推測(cè)分析，海馬體積減小初期主要是由于CA3區(qū)錐體細(xì)胞的萎縮和死亡導(dǎo)致的，而如果應(yīng)激持續(xù)存在，將主要導(dǎo)致齒狀回的顆粒細(xì)胞再生抑制及CAl區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的萎縮與凋亡。而且研究證實(shí)，應(yīng)激可以導(dǎo)致海馬CA1、CA3區(qū)域的形態(tài)學(xué)改變，這可能與海馬功能的損害有關(guān)。Sousa等[25]發(fā)現(xiàn)不可預(yù)測(cè)的慢性應(yīng)激使大鼠海馬CAl區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突總長(zhǎng)度減少13%，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的NGF在大腦皮質(zhì)和海馬等靶組織中合成，經(jīng)基底前腦膽堿能神經(jīng)元攝取，逆行運(yùn)輸?shù)桨w，對(duì)中樞神經(jīng)元的生長(zhǎng)和生存起重要作用，特別是對(duì)投射到海馬和大腦皮質(zhì)區(qū)域的膽堿能神經(jīng)元起保護(hù)作用[26]。海馬是大腦內(nèi)合成NGF的重要場(chǎng)所，也是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的重要腦區(qū)之一[27] 。研究表明，慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致海馬神經(jīng)元可塑性受損[28]，以及NGF表達(dá)的降低[29]，提示海馬NGF表達(dá)減少以致神經(jīng)元功能受損可能在抑郁癥的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期慢性應(yīng)激組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)明顯減弱，同時(shí)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，可以推測(cè)慢性應(yīng)激導(dǎo)致的海馬CA1、CA3區(qū)NGF減少可能是抑郁導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的病理機(jī)制之一。而應(yīng)激運(yùn)動(dòng)組大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)4周后海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示慢性應(yīng)激大鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)八臂迷宮成績(jī)提高可能與海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。可能的原因如下：長(zhǎng)期慢性應(yīng)激刺激導(dǎo)致下丘腦垂體腎上腺軸（HPA）功能亢進(jìn)，出現(xiàn)高CORT血癥，縫核海馬系統(tǒng)5HT等單胺系統(tǒng)傳導(dǎo)功能低下、興奮性氨基酸（EAA）釋放，受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)異常（包括Ca2+失衡），導(dǎo)致NGF含量及其mRNA水平下降[30]。研究認(rèn)為，NGF通過(guò)增加過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶等自由基清除劑的活性，對(duì)減輕神經(jīng)元損傷起重要作用[31]；也有研究表明，NGF對(duì)海馬神經(jīng)元鈣離子濃度的升高和神經(jīng)元的壞死有明顯的抑制作用[32]，而且海馬CAl、CA3區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中擔(dān)負(fù)著尤其重要的作用：因此，可以推測(cè)長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)慢性應(yīng)激大鼠學(xué)習(xí)記憶能力主要與此運(yùn)動(dòng)拮抗HPA軸功能亢進(jìn)、減少Cort分泌導(dǎo)致海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)增強(qiáng)，從而阻止氧化應(yīng)激引起的中樞神經(jīng)元死亡有關(guān)。

4 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠經(jīng)過(guò)4周慢性不可預(yù)知應(yīng)激大鼠血漿ACTH、CORT含量顯著增加，大鼠海馬CA1、CA3區(qū)NGF表達(dá)明顯減弱，提示血漿ACTH、CORT含量及NGF的變化與慢性應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠的抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，大鼠血漿ACTH、CORT含量減少，NGF表達(dá)增加，提示長(zhǎng)期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以有效調(diào)整血漿ACTH、CORT水平，上調(diào)NGF的表達(dá)，從而改善抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶能力，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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