糞腸球菌毒力因子gelE研究進展

孟慶君　高原　呂娜

摘 要：糞腸球菌與多種感染相關，明膠酶是其主要毒力因子之一，它影響糞腸球菌毒力，與糞腸球菌生物被膜形成有關。現對gelE在生物被膜形成中的作用進行綜述。

關鍵詞：糞腸球菌；明膠酶；生物被膜

中圖分類號：S85 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0542

Abstract： Enterococcus faecalis associated with a variety of infections， gelatinase is one of the major virulence factor， it affects Enterococcus faecalis virulence， and Enterococcus faecalis biofilm formation. Now the author reviewed the gelE role in biofilm formation.

Key words： Enterococcus faecalis； Gelatinase； Biofilm

0 引言

腸球菌早已被確認為條件性致病菌，經常參與傷口感染、腹腔內膿腫以及泌尿道、膽道、根管感染，主要見于免疫力低下或過量使用抗生素的患者[1]，也可以導致敗血癥、心內膜炎等從而危及生命，死亡率達21.0%～27.5%[2]。在過去的幾十年中，腸球菌已成為越來越嚴重的醫院病原體，部分原因是它普遍的多重抗生素耐藥性[3]。除了溶細胞素，其本身對廣泛的原核和真核細胞是致命的，在糞腸球菌中已發現幾個毒力相關因子，包括聚集物質（Agg）、腸球菌表面蛋白（Esp）以及2個胞外蛋白酶：明膠酶（gelatinase，gelE）和絲氨酸蛋白酶（sprE）[4]。這些因子之間協同作用，促進細菌寄居、遷移和生物被膜的形成，從而增強其毒力。在特定條件下細菌能夠形成生物被膜，從而增強對抗生素和宿主免疫系統的抵抗力，引起感染性疾病。生物被膜形成機制的研究發現密度感應系統（QS）的調控有重要作用，gelE基因作為腸球菌主要QS系統之一的fsr系統調控的下游基因，其編碼的蛋白（gelE）與糞腸球菌生物被膜形成的關系亦受到重視[5]。gelE和sprE編碼在同一個操縱子上，gelE-sprE，其表達由fsr位點編碼的密度感應系統進行調節[6]。文章對糞腸球菌主要毒力因子gelE，及其在生物膜形成過程中的作用進行綜述。

1 細菌生物被膜

細菌生物被膜是指細菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等，將其自身包裹其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，主要由細菌、高水化的多陰離子基質及被俘獲的體外的大分子組成。生物被膜是細菌的一種具有保護性的生長模式，具有結構和代謝復雜性。在特定的條件下，細菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的細菌稱為被膜菌。被膜菌無論其形態結構、生理生化特性、致病性還是對環境因子的敏感性等都與浮游細菌有顯著的不同，尤其對抗生素和宿主免疫系統具有很強的抵抗力，從而導致嚴重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復發作。細菌生物被膜粘附在各種醫療器械及導管上極難清除，以至引發大量的醫源性感染。

細菌生物被膜的致病特點包括病灶局部的炎癥反應不很強烈，感染有相互轉化的靜止期和發作期；抗菌藥物治療起初可能有效，但以后治療常常失敗；致病菌主要是來自皮膚和周圍環境中的致病菌如金黃色葡萄球菌，糞腸球菌等。

2 生物被膜形成

生物被膜的形成是一個復雜的動態過程，其形成過程可分為3個階段：初始粘附階段、聚集階段和生物被膜成熟階段。其中初始粘附是生物被膜形成的第1階段，細菌最終能否粘附于表面取決于細菌與粘附表面接觸面積足夠大和兩接觸面之間所產生的吸附力大于排斥力。細菌粘附主要是通過細菌表面特定的粘素蛋白識別宿主表面受體來完成，具有特異性和選擇性。接觸表面的蛋白、糖蛋白和糖脂可作為受體，選擇性地吸附特定種類的細菌。細菌粘附可分為可逆粘附和不可逆粘附2個階段，在可逆附著階段影響其附著作用力較弱，主要為范德華力、靜電力、疏水作用等；在不可逆附著階段，細胞通過它的運輸器官和附屬肢體如鞭毛、纖毛和胞外多聚糖纖維等來達到接觸表面。細菌粘附于表面后即調整基因表達，在生長繁殖的同時分泌大量的胞外多聚糖（exopolysaccharide，EPS），包裹、粘附細胞逐漸形成微生物群落。細菌外多聚基質包裹是生物被膜成熟階段。表面固生細菌包裹與其自身分泌的多聚糖基質中，形成了高度有組織的結構，這種結構具有不均質性，且在其中分布有可供運送養料、酶、代謝產物和排出廢物的通道。

3 明膠酶在生物被膜形成中的作用

3.1 明膠酶（gelE）

明膠酶基因gelE是糞腸球菌分泌的一種Zn金屬蛋白酶，是流行病學資料和動物模型研究中的1個致病因素。位于腸球菌染色體上，是一個28 ku或32 ku的細胞外鋅肽鏈內切酶（第二金屬內肽酶；微生物蛋白酶），長度約1530個堿基[7]，分子量約為31500，最適pH大概為6～8，等電點為4.6。其上游是糞腸球菌調節器fsr基因和3個啟動子，在轉錄水平調控明膠酶基因的表達；下游是絲氨酸蛋白酶基因sprE，由855個堿基組成，與腸球菌損傷宿主組織有關[8]。明膠酶底物特異性的研究已經表明，它與疏水性和不溶性膠原相互作用。動物模型證實明膠酶及其調節基因fsr介導菌株的毒力作用，參與炎癥進程，與腸球菌向感染灶周圍擴散有關。R. Creti[9]等的實驗結果表明，50%臨床分離菌株表達gelE，健康人分離株僅27%陽性。在含30 g/L的明膠或15 g/L的脫脂乳的半固體培養基上，蛋白酶產物很容易檢測到。C M Waters[10]等利用fsr密度感應系統在高細胞密度條件下誘導表達gelE，gelE被證明是負責一些不穩定的Asc10（聚集物質）突變體的蛋白質，這意味著gelE的功能是清除細菌細胞表面錯誤折疊的蛋白質。一個標準的雙球菌形態結構鏈是從5～10個細胞，而破壞gelE生產會導致糞腸桿菌細胞鏈增長。在化膿性鏈球菌表達蛋白時，gelE的這一功能也顯示出來。糞腸桿菌gelE表達時菌株更易自溶，這表明gelE影響細胞鏈的長度是通過激活自溶素。gelE也是聚合纖維蛋白降解的必要物質。gelE表達降低cCF10滴度，肽信息素誘導pCF10共軛，且增加了pCF10共軛到非gelE表達株中。gelE的這些功能表明它的作用是在高密度的環境中增加糞腸球菌的傳播。

3.2 gelE縮短糞腸球菌鏈

根據C M Waters等[10]試驗，使用流式細胞計數法測定菌株的向散射光。每個菌株向散射光平均值的大小證實了gelE表達株和gelE突變株之間的差異是顯著的，并且可在大范圍內觀察到。gelE表達載體pMSP3614電穿孔進入化膿性鏈球菌90-226，來測定gelE對糞腸球菌鏈長度的縮短能力是否是特效的。誘導gelE在90-226表達導致鏈長度減少，但對雙球菌單細胞并不是完全的。這表明，糞腸球菌gelE介導的鏈長度縮短的機制可能保存在化膿性鏈球菌90-226菌株中。

3.3 gelE增加糞腸球菌自溶

糞腸球菌有兩個獨特的自溶素，一個是針對其自身細胞壁（胞壁質酶-1）有活性，另一個是針對溶壁微球菌細胞壁（胞壁質酶-2）有活性。在對溶菌酶-1自溶素的初始特性描述中發現，腸球菌（糞腸球菌）液化亞種31號菌株的鋅金屬蛋白酶（gelE）是通過激活溶菌酶-1活性來加速糞腸球菌細胞壁裂解的。并且，蛋白酶抑制因子抑制胞壁質酶-1由130-kDa休眠形式轉換到87-kDa活化形式。

3.4 gelE降解聚合纖維蛋白

gelE降解纖維蛋白對糞腸球菌致病機制具有重要意義。糞腸球菌聚合纖維蛋白是OG1RF（糞腸球菌標準株）產生的一種分泌因子，可以降解纖維蛋白。檢測過濾后的蛋白酶突變株固體培養基上清液，從而檢驗其降解纖維蛋白的能力，進而確定gelE和sprE是否是負責此表型。細菌分泌的蛋白酶破壞宿主組織，使細菌遷移和擴散。糞腸球菌感染血液，腸球菌心內膜炎增殖體形成過程中可能涂有聚合纖維蛋白。可以激活fsr系統中的增殖體，導致gelE誘導表達。纖維蛋白層周圍的菌降解將使有機體進一步擴散。

3.5 gelE生物合成-激活外信息素

糞腸球菌2個毒力相關蛋白酶明膠酶（gelE）和絲氨酸蛋白酶（sprE）的表達，是由fsr基因簇編碼的密度感應系統正調控的。在此系統中，糞腸球菌分泌一種自誘導信號肽，明膠酶生物合成激活信息素（GBAP）觸發fsrC-fsrA雙組分調控系統控制2個轉錄物fsrBDC和gelE-sprE的表達。C. M. Waters等[10]將篩選出來的放線菌代謝物作為fsr群體感應的抑制劑。糞腸球菌與每個放線菌培養物上清液培養測試，并分別用第1次篩選和第2次篩選對明膠酶的生產和明膠酶生物合成激活信息素的生產進行了檢查。Y33-1株鏈霉菌的培養物上清液對明膠酶生產和明膠酶生物合成激活信息素生產有明顯的抑制作用，而對糞腸桿菌細胞生長沒有抑制作用。培養物上清液中的抑制成分是一種多肽抗素siamycin I[11]。Siamycin I在亞微摩爾濃度抑制明膠酶和明膠酶生物合成激活信息素的生產，并在微摩爾濃度以上抑制糞腸球菌細胞生長。定量分析fsrBDC和gelE-sprE轉錄物顯示，siamycin I在亞致死濃度下抑制兩個轉錄物的表達。即使向培養物外加過量的明膠酶生物合成激活信息素，siamycin I還是抑制明膠酶生產。這些結果表明，siamycin I以非競爭性方式，通過fsrC-fsrA雙組分調節系統抑制GBAP的信號肽。亞致死濃度的siamycin I也抑制生物膜的形成。

4 明膠酶調節器fsr和絲氨酸蛋白酶（sprE）

4.1 fsr調節器

糞腸球菌產生金屬蛋白酶，可以降解宿主細胞基質相關分子。大約有60%的糞腸球菌臨床分離株產生金屬蛋白明膠酶。明膠酶的表達是通過控制總體的毒力調節位點fsr[12]。明膠酶基因上游和絲氨酸蛋白酶基因下游發現3個agr相似基因fsrA，fsrB和fsrC，X. Qin等[13]試驗表明agr相似基因可能是自我調控，而且他們調節gelE和sprE表達，且gelE和fsr均是產生明膠酶所必需的。測試的fsrA，fsrB，sprE突變株小鼠腹膜炎模型顯示，與OG1RF標準株相比，sprE和agr相似基因突變株非常顯著的延長了小鼠的存活時間，與此前報道有相似的發現。在這個模型中，sprE和agr相似基因有助于增強糞腸桿菌OG1RF株的毒力。幾個使用動物或線蟲模型的體內研究已經表明，fsr系統有助于提高毒力[14]。

fsr位點包含4個基因，分別為fsrA、fsrB、fsrC和fsrD。在該系統中，明膠酶生物合成激活信息素（GBAP）形成一個環狀肽，作為自誘導肽。GBAP的前多肽原是由fsrD翻譯，然后經FsrB誘導處理，從而使GBAP達到成熟形式。當GBAP細胞外濃度積累達到閾值水平時，約為1 nm，它則觸發由組氨酸激酶（fsrC）和反應調節因子（fsrA）組成的雙組分調控系統。活化的fsrA誘導fsrBDC轉錄表達，它包含一個自動調節的循環，產生一種GBAP信號肽輔助劑，并最終誘導gelE-sprE轉錄。

4.2 絲氨酸蛋白酶（sprE）

吳等[15]利用BLAST將肺炎鏈球菌htrA蛋白酶編碼基因與糞腸球菌染色體基因組進行同源性比較，發現糞腸球菌有一個全長為851 bp的開放性閱讀框與肺炎鏈球菌htrA基因有較高的同源性，被命名為sprE。進一步研究表明，sprE基因在細菌抵抗外界溫度環境中具有一定的作用，sprE基因在細菌抵抗外界氧化環境中也有重要作用。sprE基因可能是糞腸球菌抵抗宿主內環境以及致病較為重要的因子，能夠通過對它的突變降低糞腸球菌的毒力，獲得減毒的糞腸球菌菌株[16]。

5 結語

腸球菌醫院感染病例逐漸上升，耐藥菌株日益增多，因此研究細菌生物被膜形成的相關遺傳基因調控，維持機制以及和細菌耐藥性之間的關系有十分重要的意義。通過不斷深入研究，一定能找到治療細菌生物被膜菌有關的感染疾病的有效途徑，為新型減毒活疫苗的研究提供線索，為發現新途徑攻克細菌耐藥難題奠定理論基礎。

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