基于EMA—PCR檢測技術(shù)研究進展

【摘要】傳統(tǒng)的微生物的檢測方法在對病原菌進行檢測時會造成假陽性和假陰性的結(jié)果，將DNA結(jié)合染料疊氮溴乙錠（EMA）與PCR技術(shù)相結(jié)合，是一種有效區(qū)分微生物死活細(xì)胞的檢測方法。基于EMA-PCR/qPCR的微生物檢測技術(shù)是檢疫性有害生物傳病風(fēng)險評估的新技術(shù)。

【關(guān)鍵詞】 EMA ?PCR ?微生物死活菌區(qū)分 ?微生物檢測新技術(shù)

【課題項目】重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校校級苗圃工程（2014mpxz4）。

【中圖分類號】G64 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089（2015）05-0233-01

分子生物學(xué)方法中基于PCR技術(shù)的檢測方法被越來越多地應(yīng)用于致病菌的檢測，但是傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)不僅能擴增活細(xì)胞DNA，同時自由狀態(tài)的DNA或死細(xì)胞DNA也能被擴增，導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性，因此一種能特異、快速、準(zhǔn)確檢測病原菌的方法極為迫切。

一、EMA-PCR檢測技術(shù)原理

活菌和死菌的區(qū)別之一是細(xì)胞膜的完整性，EMA是一種DNA 結(jié)合染料，其光解后形成的氮賓化合物能夠滲透進入細(xì)胞膜不完整的菌體內(nèi)，與DNA分子發(fā)生不可逆的共價結(jié)合，從而抑制其PCR擴增，但不會影響活菌DNA的PCR擴增。EMA結(jié)合PCR的檢測方法，僅以活菌的基因組DNA為檢測靶標(biāo)，能有效降低傳統(tǒng)PCR檢測的假陽性，同時能有效降低“活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)”（VBNC）菌在傳統(tǒng)培養(yǎng)法帶來的假陰性結(jié)果，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。

二、EMA-PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

目前，EMA-PCR新型微生物活體檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛用于食品微生物、環(huán)境微生物和醫(yī)學(xué)微生物的檢測中。Guy等[1]用EMA結(jié)合常規(guī)PCR的方法檢測屠宰場中有活性的沙門氏菌，這種EMA-qPCR方法成功地避免了檢測過程中的假陽性，對食品安全評估更為準(zhǔn)確。Pilar等[2]用v-PCR方法檢測軍團桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，v-PCR方法與平板培養(yǎng)法結(jié)果比較相近或略高，但是相對于常規(guī)PCR的檢測結(jié)果而言偏低或相近，表明此法能避免常規(guī)PCR檢測帶來的假陽性和平板培養(yǎng)計數(shù)法可能帶來的假陰性結(jié)果，該法用于檢測水體中的軍團桿菌。新建立的v-PCR方法在縮短檢測時間的同時保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。Trivedi等[3]用較高的EMA濃度實時定量監(jiān)測柑橘中脈中不可培養(yǎng)的柑橘黃龍病菌的含量，發(fā)現(xiàn)在感染的長春花中檢測到的病原菌含量比感染的柑橘中高，對病害的流行規(guī)律研究有重要的意義。

金黃色葡萄球菌（SA）是一種常見的高致病性革蘭氏陽性菌，對SA的準(zhǔn)確檢測十分重要，而檢測的關(guān)鍵是食品中活菌是否存在和如何準(zhǔn)確定量的問題。余以剛等[4]建立金黃色葡萄球菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)條件模型，成功建立了DNA結(jié)合EMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合檢測VBNC金黃色葡萄球菌的方法。

EMA-PCR檢測技術(shù)有效避免了傳統(tǒng)PCR檢測方法的假陽性結(jié)果和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法帶來的假陰性結(jié)果，這種新型、方便、快捷、準(zhǔn)確的微生物活體檢測技術(shù)將取代傳統(tǒng)的檢測技術(shù)成為微生物檢測的新思路。

參考文獻：

[1]Guy RA， Kappor A， Holicka J， Shepherd D， Horgen PA. Arapidmolecular-based Assay for direct quantification of viable bacteriain slaughterhouses. Journal of Food Protection， 2006，69（6）：1265-1272.

[2]Pilar DV，Lydie S，Jean MD. Viability PCR，a Culture-Independent method for rapidand selective quantification of viable legionellapneumophilacellsin environmentalwatersamples.Applied and environmental microbiology，2009，75（11）：3502-3512

[3]Trivedi P， Sagaram US， Kim JS. et al. Quantification of viable Candidatus Liberibacter asiaticus in hosts using quantitative PCR with the aid of ethidium monoazide （EMA）.European Journal of Plant Pathology，2009，124： 553-563.

[4]余以剛，田聰，肖性龍等.金黃色葡萄球菌VBNc狀態(tài)的誘導(dǎo)條件和EMA-qPCR檢測.華南理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，1（41）：127-129.

作者簡介：

熊書（1987-），女，碩士研究生，重慶萬州人，助教，研究方向：生物化學(xué)與微生物檢驗檢疫。