螺旋藻產品脂肪酸GC指紋圖譜分析方法的研究

祖 新，李羽翡，仝偉建，楊曉楠

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

螺旋藻（Spirulinasp.）是營養成分最全面、最均衡的食品之一；其含有豐富的蛋白質、氨基酸、多糖、不飽和脂肪酸、多種維生素、礦物質和微量元素等[1]。由于天然螺旋藻產量有限，不適合大工業生產，市場上的螺旋藻均為人工養殖產品，而伴隨養殖企業規模、設備、技術以及選種的差異，其產品質量的好壞也突顯出來，甚至假冒偽劣產品也充斥其中。因此，有必要建立能夠標示其化學特征的指紋圖譜，進而對螺旋藻產品質量進行有效描述和評價。

螺旋藻屬于低脂肪含量的食品，脂肪含量約為6%～9%，而且其中多為不飽和脂肪酸和一些飽和脂肪酸，尤其是含有大量的十六碳酸（棕櫚酸）、9-十六碳烯酸（棕櫚油酸）、順-9-十八碳烯酸（油酸）、順-9,12-十八碳二烯酸（亞油酸）和順-6,9,12-十八碳三烯酸（γ-亞麻酸）。多不飽和脂肪酸具有調節人體脂質代謝，維持神經系統發育，促進免疫等生理功能[2]。目前國內外雖然有多種脂質提取方法[3]，但技術實質仍是萃取?，F代脂肪酸檢測普遍采用色譜分離技術，尤其以氣相色譜（gas chromatography，GC）法最為精確，實用[4]。螺旋藻保健功能主要依賴的生物活性物質是γ-亞麻酸[5]，特征性極強，因此，可以通過測定其脂肪酸組成，來繪制螺旋藻產品指紋圖譜。本試驗采用氣相色譜法對螺旋藻產品的脂肪酸進行分析，通過內標加入，在測定脂肪酸比值同時，對目標組分定量檢測，可繪制功能完善的指紋圖譜[6]，對于提高螺旋藻產品質量，促進該保健食品現代化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻產品樣品：隨機選取市售10種不同品牌螺旋藻片劑產品，分別用A～Z中10個英文字母表示；脂肪酸甲酯標準品（棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、γ-亞麻酸甲酯、α-亞麻酸甲酯、山崳酸甲酯、芥酸甲酯）、內標（富馬酸二甲酯）：德國Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；正己烷、氫氧化鉀（KOH）、甲醇、硫酸氫鈉：天津化學試劑一廠；所用化學試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

2010型氣相色譜儀配火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）檢測器：日本島津分析儀器有限公司；SP-2560型毛細管色譜柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm）、24DL型固相萃取儀：美國Supelco公司；T-25型高速均質機：德國IKA公司；L-530型離心機：湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；SK-1型渦旋振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理[7-9]

稱取10.0 g螺旋藻產品樣品，加50 mL正己烷，用高速均質機均質破壁，使脂肪完全溶解，離心沉淀，取上清液10 mL進行分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE）凈化，以去除葉綠素等干擾，得到螺旋藻凈化液。

1.3.2 供試品溶液的制備[10-12]

取螺旋藻凈化液5 mL，加0.5 mL 2 mol/L KOH-甲醇溶液（稱取11.3 g KOH溶解于100 mL甲醇），渦旋振蕩2 min，50 ℃、30 min完成酯交換反應使油脂甲酯化，靜置至澄清，向溶液中加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，以中和剩余的氫氧化鉀，4 000 r/min離心5 min，取上清液2 mL，轉入樣品瓶，即為供試品溶液。

1.3.3 標準溶液配制

準確配制質量濃度分別為0.1 mg/mL的棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和γ-亞麻酸等脂肪酸甲酯正己烷溶液，制得標準溶液。標準溶液用于脂肪酸組分定性分析。

1.3.4 色譜條件

程序升溫：初始溫度120 ℃，保持0 min；以10 ℃/min升溫至230 ℃保持30 min；汽化室溫度：250 ℃；檢測器溫度：300 ℃；載氣（N2）流速：0.5 mL/min，氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：300 mL/min；隔膜吹掃：3 mL/min；進樣量：1.0 μL；分流比：50∶1。

根據標準溶液色譜峰的保留時間，對樣液各組分色譜峰定性，采用峰面積歸一法對脂肪酸各組分定量檢測。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸標準品的氣相色譜檢測

脂肪酸混合標準品的氣相色譜檢測結果見圖1。

圖1 脂肪酸標準品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of fatty acids standard

由圖1可知，出峰時間為34.586 min、37.450 min、38.922 min、41.114 min、42.946 min、44.088 min、45.867 min、48.465 min分別對應的脂肪酸標準品為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、山崳酸及芥酸。結果表明，各色譜峰峰形對稱，基線平穩，分離度好。

2.2 內標物氣相色譜檢測

選取富馬酸二甲酯作為內標物，配制成質量濃度為1.00 g/mL內標液，在相同色譜條件下進樣測試，得到內標物GC色譜圖如圖2所示。

圖2 內標物氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of internal standard

由圖2可知，富馬酸二甲酯可在該色譜條件下完全分離，且化學性質穩定，初步符合內標物選擇要求[13-14]。

2.3 加入內標的螺旋藻產品中脂肪酸色譜圖

在供試品測定液中準確加入1.0 μL 1.00 g/mL內標液，在相同色譜條件下進樣測試，得到加入內標的螺旋藻產品脂肪酸色圖譜如圖3所示。

圖3 加入內標的螺旋藻產品脂肪酸色譜圖Fig.3 Chromatograms of fatty acids in spirulina products with internal standard

由圖3可知，內標物與螺旋藻產品脂肪酸組分出峰時間完全分離，同被測組分有相似檢測響應，且無干擾，該內標物適用脂肪酸檢測。

2.4 螺旋藻產品中脂肪酸指紋圖譜的建立

分別取10個品牌螺旋藻產品供試品測定液各1.5 mL于樣品瓶，準確加入1.0 μL 1.00 g/mL富馬酸二甲酯內標液，振蕩混勻，注入氣相色譜儀，記錄60 min色譜圖，根據10個樣品的相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點對峰進行匹配，以保留時間的平均數建立共有模式，脂肪酸氣相色譜指紋圖見圖4。

圖4 螺旋藻產品脂肪酸指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of fatty acids in spirulina products

根據10個品牌不同供試品指紋峰的相對保留時間和峰面積的檢測結果，確定了6個共有峰作為螺旋藻脂肪酸指紋圖譜的特征指紋峰，脂肪酸的分析結果見表1。

由表1可知，該測試條件下，10批螺旋藻產品供試品中單峰面積占總峰面積＞10%的主要共有峰為：2號峰（43.5%～51.2%）、5號峰（17.2%～21.6%）及6號峰（12.3%～23.0%），這三個主要共有峰面積占總峰面積比值均＞83%，特征明顯，而共有峰總面積占總峰面積比值均＞95%，非共有峰面積占總峰面積比值均＜5%，符合指紋圖譜規定要求[15-17]。根據10批供試品的檢測，可以看出多種組分含量上有明顯不同，其中螺旋藻生物活性物質γ-亞麻酸含量波動在12.3%～23.0%，相對差值高達61%。

表1 10個品牌螺旋藻產品中脂肪酸的分析結果Table 1 The analysis results of 10 batches of fatty acids in spirulina products

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

取同一螺旋藻產品供試品溶液，在相同的氣相色譜條件下連續檢測5次，考察各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果見表2。

由表2可知，各色譜峰保留時間和脂肪酸質量濃度的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜3%，說明此方法精密度良好，符合指紋圖譜規定要求。

表2 精密度試驗結果Table 2 Results of precision experiments

2.5.2 重復性試驗

取同一批螺旋藻產品分別制備供試品溶液6份，分別注入氣相色譜儀，考察各色譜峰相對保留時間、相對峰面積的一致性，結果如表3所示。

表3 重復性試驗結果Table 3 Results of the repetitive experiments

由表3可知，各色譜峰相對保留時間和峰面積比值的RSD均＜3%，說明重復性良好，符合指紋圖譜規定要求。

2.5.3 穩定性試驗

取同一螺旋藻產品供試品溶液，分別在0（1#）、2 h（2#）、4 h（3#）、8 h（4#）、16 h（5#）時，室溫（25 ℃）條件下進行檢測，考察各色譜峰相對保留時間、相對峰面積的一致性，結果如表4所示。

由表4可知，螺旋藻產品供試品溶液在16 h內，各色譜峰保留時間和峰面積比值的RSD均＜3%，說明穩定性良好，符合指紋圖譜規定要求。

表4 穩定性試驗結果Table 4 Results of the stability experiments

3 結論

螺旋藻產品脂肪酸組分GC測定方法可靠、簡便、重現性好，按相關技術標準要求，可用于指紋圖譜的建立。本研究建立的螺旋藻產品脂肪酸GC指紋圖譜繪制方法，經方法學考察，該方法精密度、重復性和穩定性良好，均符合指紋圖譜規定要求。結果反映了螺旋藻指紋圖譜建立的實用性，可用于評價螺旋藻產品質量的依據。

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