復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

白春霞，馮 儉，蔣 川，寧海燕(.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 60072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 60072)

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復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

白春霞1，馮 儉2*，蔣 川1，寧海燕1
(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：建立復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：運(yùn)用薄層層析法(TLC)對(duì)復(fù)方金鈴四逆四物失笑散中的延胡索、白芍進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定復(fù)方中芍藥苷含量，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果：TLC圖譜顯示斑點(diǎn)清晰，分離效果好。芍藥苷在0.010 1～0.201 2mg· mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，專屬性實(shí)驗(yàn)表明其他成分對(duì)芍藥苷的測(cè)定無干擾，平均回收率及RSD均達(dá)到相應(yīng)要求。結(jié)論：所建立的方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、能有效控制該制劑的質(zhì)量。

復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒；薄層層析法；高效液相色譜法；延胡索；白芍；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)方金鈴四逆四物失笑散顆粒簡(jiǎn)稱復(fù)方失笑散顆粒,為我院名老中醫(yī)針對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)實(shí)證病機(jī)“不通則痛”，而在古方基礎(chǔ)上加減而得，主要由延胡索、白芍、枳殼、五靈脂等藥材組成，具有理氣活血、化瘀止痛之效。前期研究發(fā)現(xiàn)，該制劑對(duì)大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型有明顯的鎮(zhèn)痛作用。為了有效控制該制劑質(zhì)量，保證藥物療效，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合《中國(guó)藥典》2010年版相關(guān)藥材項(xiàng)下的分析方法[2]，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，明確復(fù)方中君臣藥延胡索和白芍的薄層層析色譜(TLC)定性鑒別方法，并采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)復(fù)方中君藥白芍中芍藥苷活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，為復(fù)方失笑散顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent LC 1260 型高效液相色譜儀；AS10300A 型超聲清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器)；HZT-A+200 型電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；FW135 型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-201337)，延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)110726-201414)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；復(fù)方失笑散顆粒由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑科提供；硅膠G(青島海洋化工廠)；乙腈(Fisher)為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層層析鑒別

2.1.1 延胡索的薄層鑒別[1-2]稱取復(fù)方失笑散顆粒3g，加入濃氨試液1mL和三氯甲烷20mL，搖勻，浸漬1h，時(shí)時(shí)振搖，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)?% 鹽酸溶液10mL使其溶解，用乙醚提取2次，每次15mL，取水層，小心棄去乙醚層，用氨試液調(diào)至pH=9，乙醚提取2次，每次15mL合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使其溶解，作為供試品溶液。稱取缺延胡索的復(fù)方失笑散顆粒3g，依供試品制備方法，同法制得陰性樣品溶液。稱取延胡索對(duì)照藥材粉末0.2g，依供試品制備方法，同法制得對(duì)照藥材溶液。另取延胡索乙素對(duì)照品，加乙醇制成0.5mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別取上述4種溶液各10μL，點(diǎn)于同一1 % NaOH溶液制備的硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘缸中約3min后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜在與對(duì)照藥材和對(duì)照品相同的位置，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾，見圖1。

圖1 復(fù)方失笑散顆粒中延胡索TLC圖譜

2.1.2 白芍的薄層鑒別[2-4]稱取復(fù)方失笑散顆粒2g，加入稀乙醇50mL，超聲溶解20min，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使其溶解，乙醚萃取2次，每次30mL，取水層，小心棄去乙醚層，用水飽和正丁醇萃取2次，每次30mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。稱取缺白芍復(fù)方失笑散顆粒2g，依供試品制備方法，同法制得陰性對(duì)照溶液。稱取白芍對(duì)照藥材粉末0.2g，依供試品制備方法，同法制得對(duì)照藥材溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成0.5mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別吸取上述4種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果顯示：供試品色譜在與對(duì)照藥材和對(duì)照品相同的位置，顯示相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品無此斑點(diǎn)，見圖2。

圖2 復(fù)方失笑散顆粒中白芍TLC圖譜

2.2 芍藥苷含量測(cè)定[2,5-6]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(15∶85)，流速：1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10μL，理論塔板數(shù)不低于3 000，分離度R>1.5。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.201 2mg· mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取復(fù)方失笑散顆粒1.06g，置于50mL的量瓶中，加入35mL稀乙醇溶液，稱定重量，超聲30min，取出，放冷，稱重，稀乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，濾液過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例稱取除白芍以外的其他藥材，同復(fù)方失笑散顆粒生產(chǎn)工藝制備陰性對(duì)照制劑，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備缺白芍陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 線性范圍考察 分別精密移取對(duì)照品溶液(濃度0.201 2mg·mL-1)0.5、1、2、3、5、7、10mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。分別吸取上述溶液各10μL注入高效液相色譜儀中，以峰面積為縱坐標(biāo)，以芍藥苷質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=14 896X+13.619，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明：芍藥苷在0.010 1～0.201 2mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 專屬性考察 按照上述色譜條件，分別精密移取芍藥苷對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果顯示：供試品色譜中與芍藥苷對(duì)照品相同保留時(shí)間處出現(xiàn)色譜峰，陰性對(duì)照色譜中未出現(xiàn)該峰，表明其他成分對(duì)芍藥苷的測(cè)定無干擾，見圖3。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液、復(fù)方失笑散顆粒供試品溶液各10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄每次的峰面積值。結(jié)果顯示：芍藥苷峰面積的RSD值分別為0.26%和0.32%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次復(fù)方失笑散顆粒(批號(hào)140618)，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別在0、4、10、16、24、36、48h精密吸取10μL注入高效液相色譜儀中，記錄每次峰面積值。結(jié)果顯示：芍藥苷峰面積RSD=2.17%(n=7)，表面供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批復(fù)方失笑散顆粒(批號(hào)140618)粉末6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄芍藥苷峰面積值，計(jì)算含量。結(jié)果顯示：樣品中芍藥苷平均含量為2.61mg·g-1，RSD= 1.04%(n=6)，表明芍藥苷在該樣品處理方法下重現(xiàn)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的復(fù)方失笑散顆粒(批號(hào)140618)6份，精密加入芍藥苷對(duì)照品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備成樣品溶液，精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積值，計(jì)算含量，測(cè)定芍藥苷的加樣回收率。結(jié)果顯示：芍藥苷平均加樣回收率為99.02 %，RSD=0.90 %(n=6)，見表1。

圖3 復(fù)方失笑散顆粒的HPLC色譜

表1 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)的復(fù)方失笑散顆粒1.06g，精密稱定，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每份樣品平行3次，照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，并計(jì)算供試品溶液中芍藥苷含量。

表2 不同批號(hào)復(fù)方失笑散中芍藥苷的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用TLC法和HPLC法對(duì)復(fù)方失笑散顆粒中君臣藥分別進(jìn)行定性鑒別和定量分析，為復(fù)方失笑散顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

薄層層析鑒別實(shí)驗(yàn)中，對(duì)延胡索的薄層展開，分別考察了正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)、正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(10∶6∶1∶0.1)、正己烷-三氯甲烷-甲醇(10∶6∶1)3個(gè)不同的展開系統(tǒng)，結(jié)果顯示:以正己烷-三氯甲烷-甲醇-二乙胺(20∶12∶1∶0.2)展開時(shí)，斑點(diǎn)清晰，且斑點(diǎn)分離效果最好。白芍薄層鑒別中，分別考察了三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶4∶5∶0.2)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)3個(gè)展開系統(tǒng)，結(jié)果顯示:以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(20∶3∶5∶0.2)為展開劑時(shí)，斑點(diǎn)分離清晰、無拖尾，展開效果最好。在芍藥苷HPLC含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)提取溶媒(甲醇、水、70%乙醇、稀乙醇)、提取方式(超聲30min、超聲1h、回流30min、回流1h)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：稀乙醇的提取率均明顯高于甲醇、水和70%乙醇;超聲法的提取效果較回流法好，超聲提取30min所得芍藥苷含量高于超聲提取1h，表明超聲提取時(shí)間與含量不呈正相關(guān)。此外，對(duì)流動(dòng)相也進(jìn)行了考察，分別按照乙腈-水(15∶85)、甲醇-0.1%磷酸水(15∶85)、乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)、乙腈-0.1%磷酸水(14∶86)、乙腈-0.1%磷酸水(12∶88)進(jìn)行洗脫進(jìn)樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)的條件下，芍藥苷理論塔板數(shù)最高，且不低于3 000，分離度也最好，分離度和拖尾因子均符合2010年版《中國(guó)藥典》附錄規(guī)定。

[1] 曹玲,馮有龍,王亞超,等.骨刺片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2011,12(3):191-195.

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Study on Quality Standard of Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe

Bai Chunxia1，F(xiàn)eng Jian2*，Jiang Chuan1，Ning Haiyan1
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan 610072,China;2.Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan 610072,China)

Objective:To establish the quality standard of Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe(FSXG).Methods:Rhizoma Corydalls and Radix Paeoniae Alba were qualitatively identified by TLC.The content of Paeoniflorin in FSXG was determinated and analyzed by HPLC.Results:TLC showed that the points were clear and the separation effect was good.There was a good linear relationship at the range of 0.010 1～0.201 2mg·mL-1for Paeoniflorin (r=0.999 9).Specificity experiment showed that other ingredients without interference to the determination of Paeoniflorin.The average recoveries and RSD were up to the requirement.Conclusion:The established methods were simple and accurate with good reproducibility which can control the quality of this preparation effectively.

Fufang Jinlingsinisiwushixiao GranuLe; TLC; HPLC;RhizomaCorydalls;RadixPaeoniaeAlba;Quality Standard

2014-01-06

白春霞(1988-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分分析和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

馮儉(1963-)，男，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分分析和中藥制劑研發(fā)。

R284

A

1673-2197(2015)11-0042-03

10.11954/ytctyy.201511017