HPLC-ELSD法同時測定澤瀉藥材中3種有效成分含量的研究

郝燕勤

(赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000)

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HPLC-ELSD法同時測定澤瀉藥材中3種有效成分含量的研究

郝燕勤

(赤峰學院 醫學院，內蒙古 赤峰 024000)

目的：建立澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種三萜化合物的含量測定方法，比較澤瀉藥材不同產地及不同炮制方式中3種三萜化合物的含量。方法：采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)，色譜柱：Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；柱溫：室溫；流動相：0.1%甲酸乙腈-水(70∶30)；流速：1.0mL/min，ELSD氣體流速：2.5L/min；漂移管溫度：90℃。結果：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的線性范圍分別為4.0～62μg(r=0.999 8)、4.8～68μg(r=0.999 7)、4.4～70μg(r=0.999 5)，平均回收率分別為97.75%、98.66%、99.13%。結論：該方法簡便靈敏，快速準確，重復性好，可用于澤瀉藥材的質量評價。

澤瀉；23-乙酰澤瀉醇B；24-乙酰澤瀉醇A；澤瀉醇A；HPLC-ELSD法

澤瀉(AlismaOrientalis(Sam) Juzep.)為澤瀉科澤瀉屬多年生水生植物，干燥塊莖入藥，性寒，味苷、淡。澤瀉為我國常用的傳統中藥，據《中國藥典》(2010版)[1]記載，澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂之功效，可用于治療小便不利、水腫脹滿、高脂血癥等疾病。澤瀉以萜類成分[2]為主，還含有多糖、少數黃酮、木脂素、植物甾醇等成分報道。其中，萜類主要以原萜烷型四環三萜和愈創木烷型倍半萜類化合物為主。研究表明，23-乙酰澤瀉醇B和24-乙酰澤瀉醇A為主要活性成分[3]，同時也是質量控制指標；24-乙酰澤瀉醇A由于結構不穩定，長時間溶解在質子溶劑中最終轉化為澤瀉醇A。本研究選取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A 三種三萜化合物進行含量測定[4]，由于三種化合物的紫外光譜圖為末端吸收，應采用HPLC-ELSD法[5]在同一色譜條件下進行測定。

1 材料與試藥

1.1 材料

儀器：FCV-10AL vp色譜儀(日本島津)；蒸發光散射檢測器(Alltech ELSD-2000ES)； 十萬分之一電子分析天平(美國Denvor公司)；KQ3200 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。對照品：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對照品為實驗室自制。通過波譜方法(1H NMR 和13C NMR)鑒定，且純度達98%以上。

藥材：不同產地及炮制方式的澤瀉藥材，購于四川、福建及廣州市清平藥材市場、安徽亳州藥材市場， 均由我校中藥學院鑒定。

1.2 試藥

試劑：甲酸、甲醇和乙腈為色譜純(Merck)；液相用水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)；流動相為1%甲酸乙腈-水(70:30)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；ELSD參數：漂移管溫度90℃，霧化氣體流速2.5L/min。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對照品適量，加甲醇分別制成濃度為0.514 4、0.532 4、0.490 4mg/mL的儲備用溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取澤瀉藥材干燥塊莖適量，粉碎成細粉，精密稱取500mg，精密加入80%的甲醇25mL，稱重，超聲提取30min，冷卻，稱重補重，混勻，濾過，取續濾液，用0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 專屬性試驗

分別取上述對照品溶液、供試品溶液進行測定。結果見圖1。

2.5 線性關系考察

精密吸取不同體積23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A對照品儲備液，逐級稀釋，制備一系列不同濃度的對照品混合溶液，分別精密吸取該梯度溶液20μL進樣，以峰面積的自然對數為橫坐標，以進樣量的自然對數為縱坐標，制作標準曲線，結果表明3種成分線性關系良好。見表1。

2.6 精密度試驗

精密吸取23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的對照品混合溶液(濃度分別為51.4、53.2、49.0μg/mL)，在上述色譜條件下，連續進樣6次，記錄峰面積，結果顯示：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的RSD分別為0.82%、1.3%、1.4%，表明儀器精密度良好。

表1 3種指標成分線性關系結果 (n=6)

2.7 重復性試驗

取同一批澤瀉藥材(編號ZX1)粉末，按“2.3”項方法制得6份供試品溶液，進樣分析，結果顯示：23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A的平均含量分別為0.08%、0.03%、0.01%，RSD分別為1.2%、1.9%、2.2%。

2.8 穩定性試驗

按“2.3”項方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12h測定，每次進樣20μL。測定23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三個化合物的峰面積，計算RSD值分別為0.22%、0.28%、0.47%。表明三種化合物的供試品溶液在12h內基本穩定。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的澤瀉藥材粉末(編號ZX1)，精密稱取0.5g，共9份，每3份為一組，分別準確加入“2.2”項對照品溶液0.5、1.0、1.5mL，按“2.3”項方法操作，依法測定。通過計算，23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種化合物的平均回收率分別為97.75%、98.66%、99.13%，RSD值分別為0.7%、1.4%、1.9%。

2.10 樣品含量測定

分別取市售不同產地及不同炮制方法的澤瀉藥材粉末，每個編號平行2份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，測定結果見表2。

3 討論

3.1 檢測器選擇

澤瀉中大多數三萜成分的最大紫外吸收波長為末端吸收，特征性不強，且受流動相影響會產生基線漂移現象。本研究中3種四環三萜化合物結構中僅有一個雙鍵、一個羰基，且不形成共軛，實驗比較的UV 210nm和ELSD檢測結果同樣證明，ELSD的基線噪音明顯小于210nm。因此，選擇ELSD檢測更合理。

3.2 流動相選擇

通過試驗結果比較可得，乙腈較甲醇的分離度好，更適合漂移管的較高溫度；同時，酸性環境會使澤瀉醇在HPLC分析中保持良好的峰形，有利于澤瀉藥材分析。因此，流動相選擇0.1%甲酸乙腈-水系統。

表2 不同來源及不同炮制方式澤瀉藥材中3種有效三萜成分含量測定結果

4 結論

文獻報道，澤瀉中的三萜類成分具有明顯的降血脂活性，《中國藥典》(2010版)澤瀉藥材項下只以單一成分23-乙酰澤瀉醇B作為標準品進行含量測定。本實驗建立了同時測定澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A三種有效成分的高效液相色譜法，且選擇ELSD作為檢測器，方法靈敏度高，簡便快速，重復性好，為深入研究澤瀉藥材的質量控制提供一定科學依據。

比較不同產地及炮制方法提取澤瀉藥材中23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇A和澤瀉醇A含量，結果發現不同產地及不同炮制提取方法澤瀉藥材中三種成分略有差別，原因可能與采集時間、海拔高度有關。有文獻報道顯示，澤瀉因春、秋季節采集、炮制提取方法不同，其利尿作用強度亦不同。因此，今后對澤瀉的化學成分、質量控制、活性評價方面，應考慮采收季節、炮制方式等影響因素。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M]. 南京：南京大學出版社，2010.

[2] 朱玉嵐，彭國平. 澤瀉的萜類化學成分研究進展[J]. 天然產物研究與開發， 2006(18)：348-351.

[3] 彭賢,黃舒,酈皆秀,等.澤瀉屬植物化學成分與藥理活性[J].國外醫藥·植物藥分冊, 2000, 15(6)：245-247.

[4] 周壇樹, 施大文. 不同產地澤瀉中主要成分的HPLC測定[J]. 中藥材, 2000, 23(11)：687-688.

[5] 黃永焯, 王寧生. HPLC-ELSD在天然藥物分析中的應用[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2001, 12(6)：444-448.

(責任編輯：李嵐春)

2015-06-23

郝燕勤(1969-)，女，蒙古族，內蒙古赤峰學院中級實驗師，研究方向為藥學分析。

R284.2

A

1673-2197(2015)22-0032-02

10.11954/ytctyy.201522013