酸棗仁湯對睡眠剝奪后大鼠海馬NO和NOS的影響*

★ 白黎明 白扇扇 崔小虎 張曉雙 (．陜西中醫藥大學附屬醫院腦病科 陜西 咸陽7000;．陜西中醫藥大學 陜西咸陽7046)

睡眠是恢復精力體力所必須的休息，睡眠剝奪(sleep deprivation)就是指各種原因所導致的睡眠減少或睡眠時間嚴重不足，是由于生理、病理因素或環境的影響而喪失了所需睡眠量的狀態，睡眠剝奪可導致機體認知功能的損害［1］。酸棗仁湯是由炒棗仁、茯苓、川芎、知母和甘草5味中藥組成，具有養心安神等功效。現代醫學研究表明酸棗仁湯抗焦慮、鎮靜催眠和抗驚厥作用、廣泛地用于治療心悸、失眠等病［2］。本課題復制大鼠睡眠剝奪模型，考察酸棗仁湯對睡眠剝奪后大鼠學習記憶、病理學、海馬組織一氧化氮和一氧化氮合酶的影響。

1 材料與方法

1．1 動物 ♂SD大鼠，SPF級，體重(250±20)g。由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗動物質量許可證號:SCXK(陜)2007－001。

1．2 藥品及試劑 SZRT水煎劑(炒酸棗仁15g，茯苓6g，川芎6g，知母6g，炙甘草3g)的所有藥材均購自陜西省藥材公司，煎煮后濃縮至2．1g生藥/mL的藥液，分裝后置4℃冰箱保存。考馬斯亮藍蛋白，NO，NOS測試盒，批號分別為20100108，20100113，20100113，均購于南京建成生物工程研究所。

1．3 器材 睡眠剝奪箱(自制);Y－迷宮(張家港市生物儀器廠)。KDC－160HR高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司);DM4000B LED智能型生物顯微鏡(德國Leica);GB－204型電子天平(瑞士梅特勒有限公司)。

1．4 分組、造模［3］、給藥 ♂SD大鼠，隨機分為大平臺對照組(對照組)、睡眠剝奪組(模型組)、SZRT高、中、低劑量組(21，10．5，5．25g生藥/kg)。連續7d進行睡眠剝奪，在睡眠剝奪箱(90 cm×70 cm×50 cm)中放置10個小平臺(直徑6．5 cm，高8.0 cm)，平臺之間距離15cm，平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1．0cm，大鼠在平臺上可飲食飲水，如果入睡就會落入水中，大鼠只能爬上平臺，這樣反復多次可達到睡眠剝奪的效果。對照組采用大平臺(直徑12cm，高8．0cm)作為對照，大鼠可以在大平臺上睡眠，入睡不會落入水中。對照組和模型組則灌服等體積的蒸餾水。SZRT高、中、低劑量組，造模期間每天ig SZRT水煎液，給藥體積l0mL/kg，連續給藥7d。

1．5 Y－maze［4］Y－maze主要應用于動物的辨別性學習，工作記憶及參考記憶的測試。它由一個中心區和其周圍連接的三條臂組成，每個臂的末端有發光源，發光臂為安全區，反之。先將大鼠放入迷宮中適應3～5min。采用隨機不休息法，安全區以無規則的次序變換開始時，對大白鼠所在支臂與另一支臂通電，動物在電擊下逃竄至燈光區后再保持l0s或30s為一次測試。然后動物所在支臂為下次測試的起始位置進行下一次測試。測試在第0d和7d進行。考察指標:(1)錯誤反應次數(error number，EN):每個實驗日進行20次訓練測試，一個實驗日完成所有反應中錯誤反應的次數。(2)主動回避率(Active avoidance reaction ratio，AAR ratio):大鼠在燈亮后但未通電的5s內完成逃避反應的次數占總反應次數的百分率。安全區燈亮，電刺激尚未開始時，大鼠即逃往安全區表明大鼠已經形成了明暗辨別條件反射。

1．6 HE 每組取3只大鼠ip 10%水合氯醛3.0mL/kg麻醉，開胸暴露心臟，將穿刺針通過左心室進入升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注37℃生理鹽水250mL，再緩慢灌注新鮮配置的4℃含4%多聚甲醛的0．1mol/L的磷酸緩沖250mL，斷頭剝離顱骨，完整取出大腦，投入到4%多聚甲醛中固定。制備石蠟切片。HE染色觀察大鼠海馬CA1區形態學。

1．7 海馬NO含量和NOS活性 各組剩余大鼠斷頭取腦，取海馬，在4℃的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，加入冷生理鹽水，于勻漿管中充分研碎，制成10%的腦組織勻漿，3000 r/min離心15min取上清液，硝酸還原酶法測定NO含量，化學比色法測定NOS活性。

2 結果

2．1 Y－maze 結果見表1。由表1可見，造模前各組大鼠的EN和AAR ratio無顯著性差異(P＞0.05)。造模第7d，與對照組比較，模型組EN明顯增多，AAR ratio明顯減少(P＜0．01)，與模型組相比，SZRT高劑量組EN明顯減少(P＜0．05)。AAR ratio增多(P＜0．01)。

表1 各組大鼠Y－maze實驗結果(ˉx±s，n=10)

圖1 各組大鼠海馬CA1區形態學(HE×200)

2．2 HE 結果見圖1。由圖1可見，對照組大鼠海馬CA1區可見緊密排列的錐體細胞。神經細胞核仁、核膜清晰可見，胞漿染色正常;模型組大鼠海馬CA1區錐體細胞排列紊亂，部分神經元大小不一，呈三角形或不規則形，胞漿嗜酸性增強，核固縮;SZRT組和模型組相比，神經細胞核固縮減少，神經元變性程度減輕，海馬CA1區完整錐體細胞數明顯增多。2．3 NO含量和NOS活性 結果見表2。由表2可見，與對照組比較，模型組大鼠海馬中NO含量和NOS活性提高(P＜0．01);與模型組比較，SZRT高劑量組NO含量和NOS活性降低(P＜0．05)。

表2 各組大鼠海馬NO含量和NOS活性的影響(ˉx±s，n=10)

3 討論

隨著生活節奏的不斷加快和特殊部門工作的需要，睡眠剝奪是一種非常普遍的現象。睡眠可影響動物的行為和生理功能，如學習記憶和認知能力［5］。睡眠剝奪日益危害人類健康，也是導致人體亞健康主要原因之一。睡眠剝奪對機體可造成危害，臨床及動物試驗均表明睡眠剝奪可引起一系列綜合癥:如消瘦，能量消耗增多，血清兒茶酚胺類激素增多，體內神經遞質的紊亂和激素水平的異常，機體免疫功能下降及條件性致病菌感染機會增加等。海馬區神經元的變化是學習記憶功能改變的基礎。NO是一種自由基氣體，參與腦內許多生理病理過程，如腦血流調節、學習記憶形成等［6］。睡眠剝奪后可導致機體NO的增多，而NO具有促進睡眠的作用，引起疲勞感和睡意。NO可通過第二信使環磷酸鳥苷(cGMP)消除氧自由基，保護腦細胞，但過量的NO又可激活氧自由基，損害腦細胞［7］。隨著睡眠剝奪時間不斷增加，可使誘導型NOS激活，產生大量具有神經毒性的NO。前期本課題組研究結果提示酸棗仁湯可改善睡眠剝奪大鼠學習記憶，可能與抑制神經細胞的凋亡和改變單胺類遞質的含量，保護膽堿能系統和抗氧化作用有關［8－9］。本次實驗的結果表明復方酸棗仁湯可提高睡眠剝奪后大鼠的學習記憶能力，可能與降低NO含量，抑制NOS活性有關。而具體機制還需要進一步探索。

［1］Giam GCK．Effeets of sleep deprivation with reference to military operations［J］．Annimals Academy of Medicine，1997，26(1):88－91．

［2］徐小平，胡銳，席志芳．復方酸棗仁湯的藥效學研究［J］．西北藥學雜志，2002，17(5):210－213．

［3］范新六，李峰，宋月晗，等．加味四逆散對睡眠剝奪大鼠PFC和海馬CA3區NMDA受體表達的調節作用［J］．世界中醫藥，2012，7(3):261－262．

［4］王躍春．Y－型電迷宮在大鼠學習記憶功能測試中的合理運用［J］．中國行為醫學科學，2005，14(1):69－70．

［5］VILLALOBOS C，ANDRADE R．Visinin－like neuronal calcium sensor proteins regulate the slow calcium－activated after－hyperpolarizing current in the rat cerebral cortex［J］．J Neurosci，2010，30(43):14 361－14 365．

［6］馬婧怡，張萬鑫，陳虹，等．松果菊苷對血管性癡呆大鼠氧化應激損傷的保護作用［J］．中國藥理學通報，2014，30(5):638－642．

［7］郜紅利，涂星，盧映，等．土家苗藥夜關門對小鼠實驗性失眠的療效觀察與機制初探［J］．中成藥，2014，36(2):63－66．

［8］張曉雙，，孫建寧，白黎明．酸棗仁湯對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響及機制研究［J］．中藥藥理與臨床，2014，30(4):8－11．

［9］張曉雙，白黎明，孫建寧．酸棗仁湯對睡眠剝奪模型大鼠學習記憶的影響［J］．中國藥房，2015，26(7):915－917．