中藥飲片鹿血晶PCR檢測(cè)方法的建立

★　沈海英　鮑方名　顧珉　張國(guó)林　黃依雯　李倩　(蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所　江蘇 蘇州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥材的分子生物學(xué)鑒定和藥品微生物檢驗(yàn)。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。

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中藥飲片鹿血晶PCR檢測(cè)方法的建立

★沈海英*鮑方名顧珉張國(guó)林黃依雯李倩(蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所江蘇 蘇州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥材的分子生物學(xué)鑒定和藥品微生物檢驗(yàn)。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。

摘要：目的：為中藥飲片鹿血晶的鑒別，建立PCR檢測(cè)方法。方法：分別提取鹿血、牛血、豬血、鹿血晶和它們的混合物的基因組，然后加入相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)。結(jié)果：用鹿、牛和豬的全血提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后它們各自PCR產(chǎn)物的大小分別為鹿408bp,牛271bp和豬149bp；用鹿特異性引物，擴(kuò)增不同動(dòng)物血液來(lái)源基因組，結(jié)果顯示該引物對(duì)鹿血具有特異性。選取市場(chǎng)上兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鹿血晶，經(jīng)PCR檢測(cè)，均檢出鹿特異性目的條帶。結(jié)論：用PCR的方法鑒別中藥飲片鹿血晶的真?zhèn)危且环N客觀可靠的方法。

關(guān)鍵詞：中藥飲片；鹿血晶；PCR；鑒別

目前市場(chǎng)上含有鹿血的保健品有十幾個(gè)品種，但是由于鹿血來(lái)源稀少及其珍貴的藥用價(jià)值，所以市場(chǎng)上鹿血成分魚目混珠，常用比較廉價(jià)的豬血、羊血、牛血等動(dòng)物血以假亂真。傳統(tǒng)的方法無(wú)法區(qū)分動(dòng)物血的來(lái)源。DNA核酸序列和特異引物PCR擴(kuò)增在動(dòng)物藥材鹿茸、鹿鞭、烏梢蛇、龜板、土鱉蟲、蜈蚣等鑒定方面都取得了良好效果[1]，但其在鹿血來(lái)源的應(yīng)用還無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此本研究為了鑒別中藥飲片鹿血晶的真?zhèn)危CR檢測(cè)方法。

1材料和方法

1.1試劑DNA提取試劑盒(天根：TIANamp Genomic DNA Kit,吸附柱批號(hào)：M1104)；DREAM Taq Green Pcr Master Mix(2×)12.5μL(Thermo Scientific，批號(hào):00108596)；引物序列見表1，由上海生工合成。

表1　鹿、牛、豬PCR檢測(cè)引物信息表

1.2藥材梅花鹿血、牛血、豬血(由蘇州市紅冠莊國(guó)藥飲片有限公司提供)；鹿血晶1購(gòu)于蘇州市紅冠莊國(guó)藥飲片有限公司(批號(hào)：1211022)；鹿血晶2購(gòu)于合肥樂(lè)家老鋪中藥飲片有限公司(批號(hào)：12040102)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器高速低溫離心機(jī)：Thermo scientific Biofuge primo R；凝膠成像系統(tǒng)：GEL DocTM XR+ Bio RAD；電泳儀：Bio-RAD Power Pac TM Basic；PCR儀：AB AppLied Biosystems。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取按試劑盒使用說(shuō)明提取鹿血(鹿全血約50μL)、牛血(牛全血約50μL)、豬血(豬全血約50μL)和鹿血晶(約15mg)的基因組DNA。

1.4.2PCR反應(yīng)體系在200 μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25 μL,DREAM Taq Green Pcr Master Mix (2×) 12.5 μL(Thermo Scientific，批號(hào)：00108596)，20μM的引物各0.75 μL，DNA模板1.25 μL，去離子水9.75 μL。陰性對(duì)照為滅菌去離子水。陰性對(duì)照試驗(yàn)除反應(yīng)中不加模板DNA外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。

1.4.3PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)見表2。

1.4.4電泳檢測(cè)稱取適量的瓊脂糖加入1×TAE緩沖液中，配置成質(zhì)量濃度為1.5%的溶液，加熱溶解，稍加冷卻后，加入GeLRed溶液至終濃度為0.1μg/mL。制膠時(shí)將凝膠倒入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中，垂直向上拔去梳版。吸取5～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣。其中一個(gè)泳道中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品3～6μL作用(按試劑說(shuō)明確定加樣量)，接通電源電泳，按5V/cm的電壓電泳30～60min。紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。

表2　3種動(dòng)物基因PCR反應(yīng)參數(shù)

1.4.5結(jié)果判斷凝膠電泳圖譜中，待測(cè)鹿血晶在與梅花鹿血液對(duì)照品凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上(408bp)，有單一DNA條帶為正品。

2結(jié)果

2.1采用文獻(xiàn)報(bào)道的鹿、牛和豬特異性基因片段引物，用鹿、牛和豬的全血提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳結(jié)果見圖1。它們各自PCR產(chǎn)物的大小分別為鹿408bp,牛271bp和豬149bp。

1.鹿血；2.牛血；3.豬血；4.陰性對(duì)照；5.DNA marker

2.2用鹿特異性引物，擴(kuò)增不同動(dòng)物血液來(lái)源基因組結(jié)果見圖2。可見該引物對(duì)鹿血具有特異性。其不能擴(kuò)增出牛和豬血的特異性條帶，而對(duì)鹿血和鹿血與其它動(dòng)物血的混合物(兩者1∶1混合)，能擴(kuò)增出特異性條帶。

1.鹿血；2.牛血；3.豬血；4.牛血+鹿血；

1.鹿血；2.鹿血晶1；3.鹿血晶2；4.陰性對(duì)照；5.DNA marker

1.DNA marker；2.鹿血晶量：29.75mg;3.鹿血晶量:15.25mg;

2.3不同來(lái)源鹿血晶PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。選取市場(chǎng)上兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鹿血晶，經(jīng)PCR檢測(cè)，均檢出鹿特異性目的條帶。

2.4不同含量鹿血晶PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。稱取不同量的鹿血晶，進(jìn)行基因組DNA提取，提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹿血晶的含量為1.51mg時(shí)(為常規(guī)用量十分之一左右)仍能擴(kuò)增出目的條帶。

3討論

中藥飲片鹿血晶為純梅花鹿或馬鹿血制成，其性熱、味甘咸，具有養(yǎng)血益精，行血祛瘀、消腫療傷等作用[4]。現(xiàn)代研究表明，鹿血制品含有豐富的造血干細(xì)胞和多種造血因子，包括G-CSF、GM-CSR、M-CSF等。目前市場(chǎng)上鹿血成分魚目混珠。有關(guān)鹿血的鑒別，雖然有免疫學(xué)抗原抗體沉淀法、聚丙酰胺凝膠電泳等方法報(bào)道，但由于方法繁瑣等原因，這些方法未能得到廣泛應(yīng)用[5]。

本研究選用的引物，針對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定其正品為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的線粒體基因設(shè)計(jì)，對(duì)鹿血基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到預(yù)期大小的目的片段；兩批市售鹿血晶飲片檢出和鹿血大小一致的目的片段；對(duì)牛血、豬血基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未得到預(yù)期大小的目的片段；對(duì)不同含量鹿血晶PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹿血晶的含量為1.51mg時(shí)(約為常規(guī)用量15mg左右的十分之一)仍能擴(kuò)增出目的條帶。故對(duì)樣品DNA提取液進(jìn)行鹿內(nèi)源基因的PCR擴(kuò)增，以鹿基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，如陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可初步判斷待測(cè)樣品含有鹿源性成分。如待測(cè)樣品未出現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，則可判斷待測(cè)樣品不含鹿源性成分(或極其微量)。

本方法的局限性：1)只能檢測(cè)出是否含有鹿血成分，無(wú)法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。2)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究選用的鹿引物是針對(duì)梅花鹿和馬鹿，而對(duì)其他品系鹿血的樣品是否可以分辨，由于取材困難，本文未做相應(yīng)的探討。3)本研究只探討了鹿血晶常見偽品血來(lái)源豬血和牛血對(duì)該方法檢測(cè)不具有干擾，而該方法對(duì)其他鹿血晶偽品血是否能有效檢出，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]白根本，張林源，劉春生，等.鹿源類中藥材DNA序列分析及馬鹿和梅花鹿的PCR鑒定[J].中草藥，2006，37(10)：1 566-1 569.

[2]劉向華，王義權(quán)，周開亞，等.鹿類中藥材的位點(diǎn)特異性PCR鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(8)：631-635.

[3]武艷軍，劉思國(guó)，陳建泉，等.PCR方法鑒別動(dòng)物血球蛋白粉的來(lái)源[J].飼料工業(yè)，2009，30(7):33-35.

[4]孫紅，李占東，薛冬，等.中藥鹿血晶治療化療后血小板減少癥的臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2012，12(9)：832-833.

[5]郭月秋，陳代賢，劉輝，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別鹿血與其它動(dòng)物血[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(3)：232.

收稿日期：(2015-06-10)編輯：翟興英

中圖分類號(hào)：R286

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B