艾灸預(yù)處理對過度訓(xùn)練致心肌損傷大鼠血漿SOD/MDA、NOS和心肌COL的影響*

★ 熊英 奚人杰 孔士琛 楊曉媛 (南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南京210023)

“治未病”是指采用一定的方法，通過增強(qiáng)機(jī)體的抗病與應(yīng)激能力，達(dá)到防治疾病或保健的目的。艾灸是中醫(yī)學(xué)“治未病”的常用手段之一，早在古代文獻(xiàn)中就有大量艾灸防治心血管疾病的記載。在競爭日益激烈的競技體育運(yùn)動中，急性力竭運(yùn)動或長期大強(qiáng)度運(yùn)動等超負(fù)荷訓(xùn)練是必不可少的，但超負(fù)荷訓(xùn)練的運(yùn)動量常導(dǎo)致心肌的損傷［1］。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)艾灸預(yù)處理對急性力竭運(yùn)動性心肌損傷有一定的防治作用，但艾灸預(yù)處理對于長期過度訓(xùn)練導(dǎo)致的心肌損傷有無保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制還不清楚。

鑒于以往的研究結(jié)果，本研究在大鼠過度游泳訓(xùn)練模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用艾灸預(yù)處理進(jìn)行干預(yù)，觀察艾灸預(yù)處理對過度訓(xùn)練大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及其對機(jī)體抗氧化能力、一氧化氮合酶的影響，為闡明艾灸預(yù)處理的心肌保護(hù)作用和機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用SPF級健康雄性SD大鼠36只，體重180～210g。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，一組2籠，均以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由飲食。室溫保持在20℃～22℃，相對濕度50～60%，光照時(shí)間為12h/d。大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表分為4組，包括正常對照組(C組，n=9)、一般訓(xùn)練組(E組，n=9)、過度訓(xùn)練組(OE組，n=8)和過度訓(xùn)練+艾灸組(OEM組，n=10)。

1.2 過度訓(xùn)練模型的建立［2］大鼠進(jìn)行為期六周的遞增負(fù)荷的過度游泳訓(xùn)練。先適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，然后適應(yīng)性游泳3d。第1周進(jìn)行不負(fù)重游泳30min。從第2周起每日游泳30min，負(fù)3%體重。第3周起游泳時(shí)間每日增加10min，直到60min，負(fù)4%體重。第4周每天游泳60min，負(fù)5%體重。第5周、第6周每天游泳60min，負(fù)6%體重。在整個(gè)訓(xùn)練期間，客觀條件始終保持相同。每周訓(xùn)練6d，每天訓(xùn)練1次，水溫32℃±2℃，室溫保持在20℃～22℃，相對濕度50%～60%。在大鼠游泳的過程中，如發(fā)現(xiàn)力竭表現(xiàn)(鼻孔沒入水面以下5～10s不能主動上浮)，便撈出水面休息5min后，繼續(xù)游滿規(guī)定時(shí)間。

1.3 分組 所有大鼠進(jìn)入動物房后，先適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。E組、OE和OEM組大鼠先進(jìn)行3d的適應(yīng)性游泳;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組在同一時(shí)間麻醉取材。

C組:大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，不游泳。

E組:大鼠常規(guī)喂養(yǎng)的同時(shí)，進(jìn)行為期6周的中等強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練，游泳時(shí)間從第1天30min逐日增加10～60min后，便不再增加，以后每日游泳訓(xùn)練60min(不負(fù)重)。

OE組:大鼠常規(guī)喂養(yǎng)的同時(shí)，進(jìn)行遞增負(fù)荷的過度游泳訓(xùn)練。

OEM組:訓(xùn)練方案同OE組，但每次在游泳后進(jìn)行艾灸預(yù)處理，所取穴位為腎俞、后三里穴，取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(李忠仁主編，中國中醫(yī)藥出版社，2003年出版)，使用自制麥粒灸艾炷，每次艾灸一側(cè)的穴位，每穴5壯。

大鼠在游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風(fēng)吹干后，或放回籠中休息，或立即進(jìn)行艾灸。

1.4 取材和標(biāo)本制備 將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉(1mL/100g體重)腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定，打開腹腔，先從腹主動脈抽取4mL的血，用抗凝管裝取待檢測;而后打開胸腔，暴露心臟，取出心臟，一部分整心放入4%多聚甲醛中固定待測;另一部分取心室部分，用生理鹽水漂洗干凈，-80℃保存。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 心臟組織形態(tài)學(xué)觀察 稱取大鼠體重、心重，計(jì)算心臟重量指數(shù)。

光鏡觀察:取心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中固定1周后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，切片后蘇木素-伊紅染色(HE染色)，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌變化。

1.5.2 血漿生化檢測 采集外周血標(biāo)本并置于EDTA管抗凝，離心分離血漿，應(yīng)用相關(guān)試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)分別測定血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的含量，操作規(guī)程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.3 Elisa測定 采集外周血標(biāo)本并置于EDTA管抗凝，離心分離血漿，應(yīng)用相關(guān)測定試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)測定內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量。

準(zhǔn)確稱取心肌組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500轉(zhuǎn)/分，離心10min，取上清40μL待測，按照試劑藥盒及說明測定心肌膠原(COL)含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件處理，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，各組采用單因素方差分析(ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’T3進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 心重、體重及心臟重量指數(shù)的改變 如表1所示，各組訓(xùn)練前的體重?zé)o顯著差異。經(jīng)過6周的游泳訓(xùn)練，各組大鼠心臟絕對重量無顯著差異，但各訓(xùn)練組大鼠體重均顯著低于C組(P＜0.01)，OE組大鼠體重顯著低于E組(P＜0.05)。各訓(xùn)練組大鼠心臟重量指數(shù)顯著增加，與C組比較有顯著差異(P＜0.01)。雖然OE組和OEM組的心臟重量指數(shù)大于E組，但并無顯著差異。

2.2 HE染色觀察 如圖1所示，C組大鼠心肌纖維排列整齊勻稱，毛細(xì)血管微動靜脈形態(tài)正常;E組大鼠心肌纖維排列整齊勻稱，毛細(xì)血管微動靜脈形態(tài)正常;而OE組大鼠心肌纖維腫脹，排列紊亂，部分?jǐn)嗔鸭熬衷顮顗乃溃⊙莛鲅^嚴(yán)重;OEM組大鼠心肌纖維也有腫脹，排列紊亂程度比過度訓(xùn)練組要輕，未見斷裂，瘀血不嚴(yán)重。

2.3 血漿SOD、MDA含量比較 見表2。與C組比較，其余三組的SOD活力值并無明顯差異;但與E組比較，OE組的SOD活力值明顯下降(P＜0.01);與OE組比較，OEM組的SOD活力值明顯升高(P＜0.05)。

與C組比較，OE組的MDA值明顯升高(P＜0.05);與E組比較，OE組和OEM組的MDA值明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OEM組的MDA值明顯降低(P＜0.05)。

與C組比較，OE組的SOD/MDA值明顯降低(P＜0.05);與E組比較，OE組和OEM組的SOD/MDA值明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OE組的SOD/MDA值明顯升高(P＜0.05)。

2.4 血漿NO含量和iNOS、eNOS活力值比較 見表3。與C組比較，OE組的NO值明顯下降(P＜0.05)。與C組和E組比較，OE組的iNOS活力值均有明顯上升(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OEM組的iNOS活力值有明顯下降(P＜0.05)。

表1 各組體重、心重及心臟重量指數(shù)的改變

圖1 各組HE染色觀察(40X)

表2 各組SOD及MDA值比較

表3 各組NO含量以及iNOS、eNOS活力值比較

表4 各組心肌COL含量的比較

與C組比較，其余三組的eNOS活力值具有顯著升高(P＜0.01);與E組和OE組比較，OEM組的eNOS活力值均明顯升高(P＜0.05，P＜0.05)。

2.5 心肌組織COL含量的比較 見表4。與C組比較，其余三組在心肌COL含量上具有顯著升高(P＜0.05，P＜0.01);與E組比較，OE組的COL含量有明顯升高(P＜0.01);與OE組比較，OEM組的COL含量有明顯下降(P＜0.05)。

3 討論

3.1 過度訓(xùn)練對心肌的損傷 適度的運(yùn)動訓(xùn)練可使心臟產(chǎn)生良好的適應(yīng)性改變，即運(yùn)動心臟，表現(xiàn)為特有的高功能、高儲備、大心臟，這是心臟生理代償變化的結(jié)果，這些變化能增強(qiáng)心臟功能，提高運(yùn)動能力。但過度訓(xùn)練可導(dǎo)致心肌損傷［3］。長時(shí)間大強(qiáng)度的運(yùn)動可導(dǎo)致運(yùn)動性疲勞和運(yùn)動性心肌損傷的發(fā)生，心肌出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化加強(qiáng)、Ca2+超載等現(xiàn)象，由于Ca2+超載是心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的重要機(jī)制之一，其改變與運(yùn)動后心肌損傷的時(shí)相性變化一致，與臨床上I/R損傷的特點(diǎn)相似，故這種心肌損傷又稱為運(yùn)動性I/R損傷［1］。近年來，大量的資料也證實(shí)氧化應(yīng)激與心肌纖維化的形成密切相關(guān)。氧自由基可激活基質(zhì)金屬蛋白酶，分解膠原蛋白，從而破壞正常的細(xì)胞外環(huán)境，導(dǎo)致各種生長因子的表達(dá)，引起心肌膠原重建，間質(zhì)重塑，從而促進(jìn)心肌纖維化。而心肌纖維化時(shí)膠原組織緊密包繞正常心肌，可以致使心肌細(xì)胞慢性缺氧，加速心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞［4］。

本研究顯示，一般訓(xùn)練可以使心肌適應(yīng)性增大，但并無膠原的增生、心肌的纖維化;機(jī)體的氧自由基代謝正常，抗氧化防御系統(tǒng)功能得到加強(qiáng)。但過度訓(xùn)練會導(dǎo)致機(jī)體的氧自由基大大增加，使機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)功能受到影響，使心肌的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，心臟由生理代償逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇缘姆蚀螅瑫r(shí)膠原增生、心肌開始出現(xiàn)纖維化。

3.2 艾灸預(yù)處理對過度訓(xùn)練所致心肌損傷的保護(hù)作用 本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，艾灸對急性力竭性運(yùn)動所致的心肌損傷有一定的保護(hù)作用。在本研究的結(jié)果顯示，艾灸預(yù)處理對于長期過度訓(xùn)練所致的心肌損傷也具有一定的保護(hù)作用，心肌的充血程度和心肌纖維的斷裂均有所減輕，心肌纖維化的程度也明顯減輕。

3.3 艾灸預(yù)處理的心肌保護(hù)機(jī)制 NO半衰期極短(僅數(shù)秒)，不易直接測定，故常通過檢測一氧化氮合成酶(NOS)來間接反映NO的代謝情況［5］。心肌組織內(nèi)的NOS主要有兩種亞型:eNOS和iNOS，eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，由eNOS催化生成的內(nèi)皮源性NO是介導(dǎo)內(nèi)皮依賴性舒張功能的主要介質(zhì)，其主要以彌散的方式進(jìn)入血管平滑肌和血流，可舒張所有類型的血管，所以在組織血管的I/R中發(fā)揮著重要的作用。iNOS在受到刺激后由炎癥細(xì)胞大量表達(dá)，其催化生成的NO可以與氧立即反應(yīng)，生成如過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等氧自由基，從而介導(dǎo)心肌的I/R損傷及內(nèi)皮功能失調(diào)。

MDA是細(xì)胞膜磷脂膜受到氧化損傷時(shí)的產(chǎn)物，其含量升高說明體內(nèi)過氧化反應(yīng)比較劇烈。而SOD是體內(nèi)清除超氧化物陰離子轉(zhuǎn)移性的酶，自由基濃度的升高可造成SOD活性的降低［6］。

本研究表明，艾灸預(yù)處理能增強(qiáng)血管內(nèi)皮eNOS的活力，改善血管內(nèi)皮功能，體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度也有所減輕，從而使過度訓(xùn)練所致的I/R損傷有所減輕。同時(shí)，艾灸預(yù)處理能一定程度抑制iNOS的活力，減少對心肌的損傷，這可能與艾灸減輕了機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使心肌損傷減輕有關(guān)。另外，艾灸使機(jī)體SOD的活力有所提高，另一方面使機(jī)體內(nèi)的SOD消耗減少，從而一定程度地糾正了機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)功能的紊亂，心肌纖維化也有所減輕。

4 總結(jié)

一般訓(xùn)練能使心肌產(chǎn)生良好的適應(yīng)性表現(xiàn)，心臟可生理性增大，心臟功能提高，體內(nèi)的氧化防御系統(tǒng)功能良好。但過度訓(xùn)練會抑制eNOS的活力，影響內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)功能紊亂，使心肌出現(xiàn)損傷，并有一定程度的纖維化和病理性的增大。艾灸預(yù)處理可以增強(qiáng)eNOS的活力，降低iNOS的活力，使血管內(nèi)皮功能提高，減輕機(jī)體的氧自由基損傷，使機(jī)體的氧化防御系統(tǒng)功能有一定的改善，從而能一定程度地減少心肌損傷，減少心肌纖維化，對過度訓(xùn)練所致的心肌損傷有一定的保護(hù)作用。

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