一種食品中亞硝酸鹽含量快速測(cè)定方法的研究

劉 靜，李月娟，許敬東，韓 玲

（1.甘肅省食品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

亞硝酸鹽作為一種國(guó)家允許使用的食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于腌制香腸、臘肉和火腿等肉制品中[1]。其可緩慢的分解釋放出一氧化氮（NO）使肉中的肌紅蛋白亞硝基化形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白色素，改善肉制品的色澤和風(fēng)味；同時(shí)，亞硝酸鹽還可抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，防止肉類制品的腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)肉制品的保質(zhì)期[2-3]。然而，亞硝酸鹽不僅本身具有毒性，而且常因使用過(guò)量或使用方法不當(dāng)而嚴(yán)重危害人體健康[4-5]。若亞硝酸鹽使用過(guò)量（＞150 mg/kg），會(huì)導(dǎo)致殘留的亞硝酸根和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物仲胺結(jié)合生成亞硝胺，亞硝胺在人體內(nèi)達(dá)到一定劑量時(shí)可致癌、致畸、致突變；體內(nèi)過(guò)量的亞硝酸鹽還可使血液中的二價(jià)鐵離子氧化為三價(jià)鐵離子，使正常紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，失去攜氧能力，引起組織缺氧，發(fā)生亞硝酸鹽中毒[6-7]。亞硝酸鹽可從以下幾個(gè)途徑而來(lái)：直接添加到食品中或由添加的硝酸鹽轉(zhuǎn)化而來(lái)的亞硝酸鹽、蔬菜或淹漬食品中產(chǎn)生的亞硝酸鹽、環(huán)境中產(chǎn)生的亞硝酸鹽、燃燒石油類燃料、煤炭、天然氣等產(chǎn)生的亞硝酸鹽等[8-9]。

有關(guān)食品中亞硝酸鹽檢測(cè)的研究報(bào)道很多，主要研究的是亞硝酸鹽的定性檢測(cè)和定量檢測(cè)兩種。亞硝酸鹽的定性檢測(cè)方法主要有試劑盒法和試紙法[10]；定量檢測(cè)方法主要有：光度法（分光光度法、催化光度法、熒光光度法、流動(dòng)注射分光光度法），化學(xué)發(fā)光法，電化學(xué)法（伏安法、極譜法），色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜法、離子色譜法），毛細(xì)管電泳法[11]等。以上定量檢測(cè)方法均具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，但這些方法都需要借助儀器來(lái)完成，而且所需儀器設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，同時(shí)對(duì)方法的精密度要求也較高，不易達(dá)到[12]。因此，尋求操作簡(jiǎn)單且易于實(shí)現(xiàn)的亞硝酸鹽檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，市場(chǎng)上常用的亞硝酸鹽檢測(cè)試劑盒或試紙大多是根據(jù)國(guó)標(biāo)方法制成的[13]。國(guó)標(biāo)法存在兩個(gè)關(guān)鍵性的問(wèn)題：首先，必須在酸性環(huán)境中進(jìn)行，酸度的高低直接影響產(chǎn)物的生成；其次，分兩步完成，中間反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的高低也直接影響產(chǎn)物的生成[14-15]。為了解決傳統(tǒng)方法存在的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)研究了一種新的亞硝酸鹽快速檢測(cè)方法，利用亞硝酸鹽和鹽酸間苯二胺發(fā)生重氮化偶聯(lián)反應(yīng)的原理，以定性中速濾紙為原料，通過(guò)在不同濃度的偶聯(lián)試劑中浸泡，采用不同的試紙干燥法，最終確定了試紙顯色的最佳條件。本方法與傳統(tǒng)方法相比具有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）反應(yīng)中用到的顯色劑鹽酸間苯二胺本身攜帶酸根，可以直接提供反應(yīng)所需的酸性環(huán)境，無(wú)需外加其他酸，避免了外加酸對(duì)反應(yīng)酸度的影響；（2）該反應(yīng)一步完成，不存在中間反應(yīng)，從而提高了產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。該方法最低檢出限可達(dá)1.0 mg/L，而且實(shí)驗(yàn)所用試劑易得、操作簡(jiǎn)單，所用試紙攜帶方便，成本低廉，能滿足亞硝酸鹽定性和半定量檢測(cè)的需求，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞硝酸鈉：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；鹽酸間苯二胺：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙酸鋅溶液：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；亞鐵氰化鉀溶液、硼酸鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；對(duì)氨基苯磺酸：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；鹽酸萘乙二胺：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；定性濾紙及定量濾紙：杭州沃華濾紙有限公司；層析濾紙：上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DU-20G電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；Evolution 60型紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)利用亞硝酸鹽與鹽酸間苯二胺發(fā)生重氮化偶聯(lián)反應(yīng)，生成橙紅色偶聯(lián)產(chǎn)物環(huán)偶氮亞氨基苯的原理，隨著亞硝酸鹽濃度的增大，產(chǎn)物的顏色逐漸加深，通過(guò)優(yōu)化顯色劑濃度、顯色時(shí)間、浸泡時(shí)間以及選擇色階明顯、變形程度小的試紙材料和最佳的干燥方式，找到了一種試劑盒法和試紙法快速檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的新方法。實(shí)驗(yàn)通過(guò)將顯色后的樣液和試紙條與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對(duì)比，根據(jù)顏色的深淺就可以大致判斷亞硝酸鹽的含量范圍。反應(yīng)式如下：

1.3.1 試劑盒檢測(cè)法

（1）標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制作

配制質(zhì)量濃度為1.0 g/L的鹽酸間苯二胺溶液，分別與質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、15.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、50.0 mg/L和80.0 mg/L的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行顯色，制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡。不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽顯色結(jié)果如圖1所示。

圖1 試劑盒法檢測(cè)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)比色卡Fig.1 Standard color cards of sodium nitrite detected by kit methods

（2）試樣檢測(cè)

液體樣品：直接取澄清的液體樣品1.0 mL加入檢測(cè)管中，蓋上蓋，將試劑混勻，顯色10 min后與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比較，讀取結(jié)果；固體樣品：取粉碎均勻的固體試樣1.0 g于潔凈干燥的比色管中，加入10.0 mL蒸餾水，搖勻后浸泡10 min，取上清液參照液體樣品的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 試紙檢測(cè)法

（1）試紙條的制作

分別選用定性（快、中、慢速）濾紙、定量（快、中、慢速）濾紙和層析濾紙進(jìn)行試驗(yàn)，將試紙剪成長(zhǎng)4 cm，寬1 cm的大小，分別在不同質(zhì)量濃度的顯色劑中浸泡不同的時(shí)間，取出后采用不同的干燥方式進(jìn)行干燥，然后用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉溶液進(jìn)行顯色，通過(guò)比較，選擇顯色速度快、顏色變化明顯、變形程度小的濾紙作為試驗(yàn)用試紙材料。

（2）標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制作

分別配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、30.0 mg/L、50.0 mg/L和80.0 mg/L的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，將選擇好的試紙分別浸入上述溶液中，待試紙完全浸透后取出，加顯色劑使之顯色，采用真空干燥的方式使制得的試紙條干燥，即為標(biāo)準(zhǔn)比色卡。

（3）樣品檢測(cè)

液體樣品：用潔凈干燥的容器取樣品適量，將試紙條全部浸入樣液，待顯色10 min后取出，將試紙條水平放置，與標(biāo)準(zhǔn)比色卡比較，讀取結(jié)果；固體樣品：取10 g樣品研碎后放入潔凈干燥的容器中，加適量蒸餾水浸泡大約10 min，取上清液參照液體食品的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色條件的確定

2.1.1 顯色劑濃度

室溫條件下分別配制一系列不同質(zhì)量濃度的顯色劑鹽酸間苯二胺，將選擇好的試紙條浸入各溶液中，浸泡一定的時(shí)間后取出，采用40 ℃真空干燥的方式干燥1 h，然后浸入不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉溶液中10 min使其顯色，取出后觀察各自的顯色情況。通過(guò)比較，最終選擇30.0 g/L作為顯色劑的最佳顯色質(zhì)量濃度。不同濃度顯色劑的顯色情況見表1。

表1 不同濃度顯色劑的顯色情況Table 1 Color developing agent of different concentrations

2.1.2 顯色時(shí)間

分別制作一系列用不同質(zhì)量濃度顯色劑浸泡過(guò)的濾紙條，經(jīng)40 ℃真空干燥1 h后取出，再用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉進(jìn)行顯色，分別顯色2 min、5 min、7 min、10 min、15 min、20 min，結(jié)果見表2。

表2 時(shí)間對(duì)顯色效果的影響Table 2 Effect of time on coloring

由表2可知，2 min后開始顯色，到達(dá)10 min時(shí)顏色變化趨于穩(wěn)定，以后基本保持不變，所以，本實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為最佳的顯色時(shí)間。

2.2 試紙材料的選擇

表3 不同濾紙對(duì)顯色效果的影響Table 3 Effect of different filter paper on coloring

本實(shí)驗(yàn)分別選取定性（快、中、慢速）濾紙、定量（快、中、慢速）濾紙和層析濾紙作為試紙材料，在30.0 g/L鹽酸間苯二胺中浸泡一定的時(shí)間，經(jīng)真空干燥后與亞硝酸鈉進(jìn)行顯色，觀察濾紙的顯色情況和變形程度，結(jié)果見表3。

通過(guò)比較，本實(shí)驗(yàn)選擇顯色速度快、色階變化明顯、基本無(wú)變形的定性中速濾紙作為制作試紙條的最佳材料。

2.3 浸泡時(shí)間的選擇

以定性中速濾紙為材料，分別在30.0 g/L的顯色劑中浸泡5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，當(dāng)浸泡時(shí)間＞10 min后，顯色劑在濾紙上的吸附已基本達(dá)到平衡，結(jié)合溫度、溶液的pH值、接觸時(shí)間等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇浸泡時(shí)間為20 min。

2.4 試紙烘干方式的選擇

對(duì)浸泡過(guò)的濾紙條采用不同的方式進(jìn)行干燥，通過(guò)對(duì)比，選擇最佳的干燥方式。結(jié)果如表4所示。

表4 不同干燥方式對(duì)顯色效果的影響Table 4 Effect of different drying methods on coloring

由表4可知，經(jīng)40 ℃真空干燥過(guò)的試紙條顯色效果最佳，其余干燥方式的顯色效果均有底色干擾。這是由于濕潤(rùn)的試紙受到空氣中氧氣的氧化或者發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)而發(fā)生了變質(zhì)，從而造成一定的試驗(yàn)誤差。

2.5 保質(zhì)期試驗(yàn)結(jié)果

在低溫避光條件下保存試紙，分別保存1 d、2 d、5 d、1周、2周、3周、1個(gè)月，然后用不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)其顯色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用不同保存時(shí)間保存的濾紙條，其顯色時(shí)間和顏色變化基本一致，表明采用該方法制得的試紙條的穩(wěn)定性較好，可在低溫避光條件下保存1個(gè)月。

2.6 檢測(cè)限評(píng)價(jià)

用已經(jīng)制備好的試紙對(duì)不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鈉進(jìn)行顯色，結(jié)果如表5所示。

表5 亞硝酸鈉檢測(cè)限評(píng)價(jià)Table 5 Detection limit evaluation of sodium nitrite

由表5可知，該方法的最低檢出限為1.0 mg/L，檢測(cè)范圍為1.0～80.0 mg/L。

2.7 方法評(píng)價(jià)

分別用國(guó)標(biāo)方法和試紙法對(duì)試驗(yàn)采集到的香腸樣和火腿腸樣進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6，優(yōu)缺點(diǎn)比較見表7。

表6 國(guó)標(biāo)法與試紙法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 6 Comparison of detection result by National Standard method and test paper method

表7 試紙法與國(guó)標(biāo)法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 7 Advantages and disadvantages comparison between National Standard method and test paper method

由表6、表7可以看出，采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定3種樣品亞硝酸根含量的結(jié)果均在試紙法的測(cè)定范圍內(nèi)，且操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短。所以，在對(duì)測(cè)定結(jié)果要求不太嚴(yán)格的情況下，可以采用試紙法進(jìn)行半定量的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以定性中速濾紙為試紙材料，鹽酸間苯二胺溶液為顯色劑，通過(guò)優(yōu)化顯色劑濃度、顯色時(shí)間等影響因素，得到了制備試紙的最佳條件：將定性中速濾紙?jiān)?0.0 g/L鹽酸間苯二胺中浸泡20 min，經(jīng)40 ℃真空干燥后，低溫避光條件下密封保存。該方法最低檢出限可達(dá)1.0 mg/L，檢測(cè)范圍為1.0～80.0 mg/L，制得的試紙條攜帶方便，制作成本低廉，且能滿足一般食品中亞硝酸鹽定性和半定量檢測(cè)的需求。

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