琥珀酸產生菌固體發酵動力學研究

馬莉岷，戰偉超，于 江，林 劍，徐世艾*

（1.煙臺大學 化工制造省級重點實驗室，山東 煙臺 264005；2.山東魯花生物科技有限公司，山東 煙臺 264005）

琥珀酸鈉具有明顯的海鮮貝類滋味，廣泛用于方便面海鮮湯料、肉制品、醬油、海鮮類產品等食品及其加工領域[1]。琥珀酸鈉作為調味品其主要特征：具有貝類風味，是提高食品美味的一種新型呈味物質；可與其他調味品以一定的比例混合使用可起到協同增效的作用；琥珀酸鈉在調味的同時，還能緩和其他調味品的刺激（如鹽味）；由于琥珀酸鈉具有良好的熱穩定性，故可廣泛的使用在需要熱處理的食品加工中；琥珀酸鈉滲透性強，增強了其調味效果，同時它又是不揮發性有機酸，具有一定的防腐作用。綜上所述，琥珀酸鈉作為新型的增鮮劑將具有良好的發展趨勢[2]。

用于醬油生產的AS3.024或其誘變菌株在發酵過程中只能產生微量的琥珀酸。而目前發酵法生產食用級琥珀酸還未實現規模化和產業化，生產成本限制了其在醬油中的使用，最重要的是直接在醬油中添加琥珀酸也難以被消費者接受[3-5]。因此，本研究致力于在發酵過程中提高醬油中琥珀酸的含量，增加其鮮味。

近年來，國內外相關研究主要集中于琥珀酸菌種的選育和發酵培養條件優化等方面[6-7]。相比于菌種的誘變選育和丁二酸的分離純化所做的工作，有關于琥珀酸產生菌在多菌種釀造醬油中的應用研究鮮見報道[8-9]，針對丁二酸固體發酵動力學的研究也很少，劉曉艷等[10-11]從釀酒大曲中成功分離篩選出一株琥珀酸產生菌，該菌具有淀粉、蛋白水解能力，系一株真菌門（Fungi）、藻菌綱（Phycomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor）、總狀枝毛霉組（Racemousus）中的總狀枝毛霉（M.racemosusFresenius），將其命名為SH-20。SH-20固體制曲所得成曲按照一定比例與AS3.024成曲混合后，采用高鹽稀態釀造工藝，得到的成品中琥珀酸含量明顯提高，含量達0.48 g/100 mL。為了進一步探究其最適發酵條件，最終實現工業化規模生產。因此，在對琥珀酸產生菌SH-20發酵培養基和發酵條件研究的基礎上，對該菌株的固體發酵動力學進行了初步研究，建立了琥珀酸產生菌SH-20菌體生長、產物形成和底物消耗動力學模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琥珀酸產生菌SH-20：煙臺大學生物工程實驗室保藏。

斜面培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

固體制曲培養基：豆粕12 g，潤水20 min后蒸料，再加入小麥粉8 g，滅菌20 min，pH自然。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱、PHG-9245A電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技有限公司；7200紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；2487高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

菌懸液的制備：刮取斜面培養基中的孢子于生理鹽水中，振蕩5 min，用血球計數板測定孢子濃度。

培養基的制備：按1.1方法配制培養基。

發酵：待培養基冷卻后吸取菌懸液接種于培養基中，使含水量為62%的固體培養基中接種量為4.4×105個/g，30 ℃培養箱中培養72 h。

1.3.2 分析方法

（1）底物干質量的測定

取不同發酵時間的培養物，將固體曲于60 ℃烘干至恒質量，底物干質量計算公式如下：

（2）菌體量的測定

采用核酸測定法[12-13]。

（3）琥珀酸含量的測定

樣品處理：稱取5 g烘干后的固體曲、粉碎、60 ℃浸提4 h、5 000 r/min離心20 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾由HPLC測定琥珀酸含量。

色譜條件：色譜柱為YMC-pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V（甲醇）∶V（0.02 mol/L KH2PO4）=7∶93，pH 2.5流動相流速0.5 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長214 nm。

1.3.3 數據處理方法

應用Origin8.0軟件處理實驗數據和模型，擬合出所有模型參數，建立發酵動力學數學模型。

2 結果與分析

2.1 琥珀酸產生菌固態發酵過程中主要參數的變化情況

對琥珀酸產生菌固體發酵產丁二酸過程中主要參數底物消耗、菌體生長和琥珀酸合成的變化情況進行了測定，結果見圖1。從圖1可以看出，發酵過程中，琥珀酸的合成與菌體生長同步，增長趨勢基本一致。而底物消耗呈先快后緩的趨勢。在經過很短的延遲期后，菌體進入對數生長期，同時伴隨琥珀酸的生成，底物消耗用于菌體生長和琥珀酸產生。到72 h左右，進入生長穩定期，底物消耗減緩，產物濃度變化也小，發酵周期可控制在72 h左右。

圖1 琥珀酸產生菌固體發酵過程Fig.1 Solid-state fermentation process of succinic acid producing strain

2.2 固態發酵動力學模型的建立

2.2.1 菌體生長動力學模型

Monod模型作為描述菌體生長最簡單且有效的模型，是典型的決定論均相非結構模型。此方程基于單一生長限制性底物，其他營養成分不影響微生物生長；假設菌體得率為常數，且沒有動態滯后的情況，這兩種假設不符合琥珀酸發酵的特征，采用Monod方程有偏差[14]。

而Verhulst-Pearl提出的Logistic方程是一個典型的S型曲線，能反映菌體濃度增加對自身生長的抑制作用，能較好的擬合發酵過程的菌體生長規律[15]。

菌體生長可用Logistic模型來描述，即：

式中：X為菌體濃度，mg/g；μmax為最大比生長速率，h-1；Xmax為最大菌體濃度，mg/g。

2.2.2 產物形成動力學模型

微生物的產物形成過程非常復雜，GADEN E L[16]將產物合成與菌體生長及底物消耗相關聯，定性的將發酵過程分為3種類型：①生長偶聯型：只是在菌體生長時才有產物生成；②部分偶聯型：在菌體生長時有部分產物形成，大部分產物是在菌體處于生長穩定期形成的；③非偶聯型：細胞存在，產物就會生成。Luedeking-Piret方程對一般發酵過程原則上都適用。因此選用式（2）描述產物琥珀酸的動力學模型。

式中：α為產物合成系數；β為非生長偶聯系數；p為琥珀酸含量，mg/g。

2.2.3 底物消耗動力學

底物的消耗用以菌體維持、菌體生長和產物消耗，常用的底物消耗動力學模型基于底物消耗的物料恒算建立的方程式，常用模型為：

式中：S為底物減質量，%；Ke為維持系數；yX/S為菌體得率系數。

2.3 動力學模型的求解和擬合

2.3.1 菌體生長動力學模型的求解

對式（1）進行積分可得：

用Origin8.0軟件按上式（4）進行非線性曲線擬合，得到菌體濃度X隨時間變化的函數為：

根據式（5）可計算出不同時間的菌體濃度，該方程與發酵過程中的實驗數據較好的擬合，其平均擬合誤差為0.44%，由圖2可以看出，計算值與實驗值基本吻合。可計算出其最大菌體濃度Xmax=33.382 mg/g，菌體的初始濃度X0=1.695 mg/g，最大比生長速率μmax=0.067 h-1。

圖2 SH-20發酵過程中菌體濃度隨時間變化曲線Fig.2 Changing curves of bacteria concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.2 產物生產動力學模型的求解

將式（1）帶入式（2）并積分：

將μmax=0.067，X0=1.695 mg/g，Xmax=33.382 mg/g 代入產物生成動力學模型，整理成：

通過Origin8.0軟件對發酵過程中琥珀酸合成的實驗數據進行處理，可求得α=1.736，β=-0.001 1，因此琥珀酸合成動力學表達式為：

該方程與實驗所得數據能較好地擬合，結果如圖3所示。

圖3 SH-20發酵過程中琥珀酸含量隨時間變化曲線Fig.3 Changing curves of succinate concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.3 底物消耗動力學模型的求解

為簡化模型，菌體呼吸等維持代謝消耗歸結在長菌消耗之內。琥珀酸產生菌的基質消耗大體可分為長菌消耗和生成琥珀酸產物消耗兩部分。底物消耗的動力學模型簡化為：

其中yX/S為細胞收率系數；yp/S為纖維素產率系數，令1/yX/S=A，令1/yp/S=B。

將式（1）和式（2）帶入式（9）積分得：

通過Origin8.0軟件對其進行非線性回歸擬合得到：1/yX/S=-0.002 6，1/yp/S=-0.389 6。

因此底物消耗動力學方程為：

該方程與實驗所得數據能較好地擬合，結果如圖4所示。

圖4 SH-20發酵過程中底物隨時間變化曲線Fig.4 Changing curves of substrate consumption during strain SH-20 fermentation

3 結論

采用Logisstic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程，結合琥珀酸產生菌SH-20發酵特征分析，建立了SH-20固體發酵過程中菌體生長、產物合成以及底物消耗隨時間變化的發酵動力學模型，將模型預測值與實驗值進行比較，結果表明所建立的模型能就較好預測實際發酵過程，對于優化發酵工藝，進一步放大具有重要的指導作用。

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