固相萃取和同位素內標法檢測白酒中氨基甲酸乙酯

王 健，艾濤波，岳清洪

（四川省食品藥品檢驗檢測院（東區），四川成都，610100）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）具有致癌作用，如今被廣泛用于工業涂料及動物麻醉[1-2]。研究發現，氨基甲酸乙酯也是發酵食品（如醬油、酵母、奶酪）和酒精飲料（如黃酒、白酒、葡萄酒）的副產物[3-6]。而白酒作為一種深受我國大眾喜愛的酒精飲料，市場規模龐大，有報道稱[7-8]，中國白酒到2016年將占到全球烈酒消費量的近50%，因而針對氨基甲酸乙酯殘留量的測定對于我國食品安全和公眾健康都有著極為重要的意義。

目前關于食品氨基甲酸乙酯的檢測，我國僅有進出口商品檢驗行業標準SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質譜法》[9]以及吉林省地方標準DBS 22/011—2013《飲料酒中氨基甲酸乙酯的測定氣相色譜-質譜法》[10]，而氨基甲酸乙酯的食品安全國家標準尚處于征求意見階段。SN/T 0285—2012先采用二氯甲烷液液萃取，然后用正己烷和PSA凈化后進行分析，該方法操作費時繁瑣，且回收率不穩定。DBS 22/011—2013和食品安全國家標準（非正式文本）均采用固相萃取技術，方法簡便易操作，但洗脫時采用的乙醚屬于易制毒試劑，購買比較麻煩[11-12]。本實驗采用氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱對酒中的氨基甲酸乙酯進行提取凈化，同位素內標法進行定量[13]，樣品處理步驟簡單迅速，無需其他除雜過程（如正己烷淋洗小柱），且二氯甲烷用量較少，不使用乙醚，采用同位素內標法也可以避免前處理造成的誤差，方法具有較高的靈敏度和準確度，在國家標準之外，可供各檢測機構參考用于白酒氨基甲酸乙酯檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純）、二氯甲烷（色譜純）：美國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純）；D5-氨基甲酸乙酯標準品（純度99.6%）：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯標準品（純度99.7%）：美國AccuStandard公司；氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱（Cleanert EC-SPE購于Agela，4 g/25 mL）。白酒：市售。

1.2 儀器與設備

6890N/5973i氣相色譜質譜儀：美國安捷倫公司；FA2004N分析天平（感量0.000 1 g）：上海菁華公司；Laborota 4000旋轉蒸發儀：德國heidolph海道夫公司；DragonLab MX-S漩渦混合器：深圳良誼公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

內標（D5-氨基甲酸乙酯）溶液的配制：準確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）D5-氨基甲酸乙酯標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質量濃度為100 μg/mL的內標儲備液。取上述儲備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質量濃度為1 μg/mL的內標使用液，于4 ℃冰箱內保存。

標準曲線的繪制：準確稱取約10 mg（精確至0.000 1 g）氨基甲酸乙酯標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到質量濃度為100 μg/mL標準儲備液。再取上述儲備液1 mL用乙腈定容至100 mL，得質量濃度為1 μg/mL的標準使用液。用乙腈逐級稀釋使用液，并加入內標，得到質量濃度為0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL（其中內標D5-氨基甲酸乙酯質量濃度為0.2 μg/mL）的標準溶液，用于繪制標準曲線。

1.3.2 氣相色譜-質譜操作條件

氣相色譜（gas-chromatography，GC）條件：毛細柱HP-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度230 ℃；載氣：高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：60 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min速率升至150 ℃，保持1 min；使用不分流進樣，進樣量為1 μL。

質譜（mass spectrometry，MS)條件：接口溫度為240 ℃；電離方式為電子電離源（electron ionization，EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；掃描模式為單離子檢測掃描（single ion monitoring，SIM）；氨基甲酸乙酯監測離子：62，74，89，其中定量離子為62；D5-氨基甲酸乙酯監測離子：64，76，89，其中定量離子為64；溶劑延遲時間為13.5 min。

1.3.3 樣品處理

稱取4 g 白酒于50 mL 樣品瓶中，加入內標0.4 mL，渦旋混合均勻，將樣品加入氨基甲酸乙酯專用凈化柱上，靜置10 min以保證樣品和填料充分濕潤（可用真空泵施加負壓以利于填料的吸收）。用20 mL二氯甲烷分兩次洗脫，雞心瓶收集洗脫液，將洗脫液在40 ℃條件下真空旋轉蒸發至近干，用2 mL乙腈洗滌雞心瓶，隨后加入少量無水硫酸鈉，靜置片刻，用有機相濾膜進行過濾，取少量入進樣瓶，使用上述儀器條件上機檢測。

1.3.4 樣品定性與定量

質譜儀進行測定，在扣除背景后的樣品質譜圖中，所選擇的離子全部出現，同時所選擇的離子豐度比與標準品相關離子的相對豐度一致，且波動范圍在容許偏差之內，可判定樣品中存在氨基甲酸乙酯。用內標法計算樣品中氨基甲酸乙酯的濃度。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

在上述色譜柱和色譜條件下，氨基甲酸乙酯與內標分離效果好，峰形對稱，靈敏度高。氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖如圖1所示。氨基甲酸乙酯的保留時間為14.12 min，D5-氨基甲酸乙酯的保留時間為14.03 min，兩者的保留時間較接近，定量離子無干擾。分別提取氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的定量離子62和64，其定量離子色譜圖見圖2。氨基甲酸乙酯的質譜圖見圖3，D5-氨基甲酸乙酯的質譜圖見圖4。

圖1 氨基甲酸乙酯和D5-氨基甲酸乙酯的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatorgraphy of ethyl carbamate and D5-ethyl carbamate

圖2 D5-氨基甲酸乙酯(A)和氨基甲酸乙酯(B)的定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatography of D5-ethyl carbamate (A)and ethyl carbamate (B)

圖3 氨基甲酸乙酯質譜圖Fig.3 Mass spectra of ethyl carbamate

圖4 D5-氨基甲酸乙酯質譜圖Fig.4 Mass spectra of D5-ethyl carbamate

2.2 標準曲線及方法檢出限

將配制的標準溶液在設置好的儀器條件下進行檢測，然后繪制標準曲線，得到的線性方程為y=6.003x+5.692E-003（相關系數為0.999），其中x為峰面積，y為目標物質量分數（μg/g），根據標準品最低濃度色譜圖的信噪比S/N=3計算，此方法檢出限為1 μg/kg。

2.3 加標回收率及精密度

向酒樣中添加適量的標準溶液，每個質量濃度水平下做6次平行實驗，測定加標回收率，平均回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表1。由表1可知，本方法具有較好的精密度和回收率，可以滿足測定要求，樣品中有少量的氨基甲酸乙酯檢出，故加標樣品本底為陽性樣品。白酒樣品色譜圖見圖5，白酒樣品加標色譜圖見圖6（加標質量濃度為0.25 μg/mL）。

表1 白酒加標回收率及精密度Table 1 The recovery rate and precision of liquor

圖5 白酒樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of Chinese liquor sample

圖6 白酒樣品加標色譜圖Fig.6 Chromatogram of Chinese liquor with standard substance

3 結論

實驗結果表明，使用該氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱和同位素內標法檢定白酒中氨基甲酸乙酯能有較好的穩定性和回收率，該方法對二氯甲烷的需求量也不高，在做好檢驗員防護的情況下，也是較為安全的。同時，該氨基甲酸乙酯專用柱具有一定的除雜能力，對白酒中的氨基甲酸乙酯能有較高的靈敏度，快速、簡便，可應用于大批量樣品的前處理。

利用該方法隨機抽取市面上銷售20種白酒產品，氨基甲酸乙酯檢出率為92.1%，含量約為0.01～0.2 μg/g，和國內文獻報道的結果一致[14-16]。

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