黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝條件的研究

田延軍，張家祥，楊麗萍，喬 君，趙祥穎，范宜曉，劉建軍*

（1.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，山東 濟南 250013）

葡萄糖酸鈉是一種多羥基有機酸鹽，又稱五羥基己酸鈉，在醫(yī)藥、化工、食品等領域具有廣泛的用途[1]。近十幾年來，葡萄糖酸鈉作為緩凝劑、減水劑在建筑混凝土行業(yè)的大量使用[2]，使其市場需求量快速增長，刺激了葡萄糖酸鈉生產技術的研發(fā)熱情和生產規(guī)模的快速增長[3]。葡萄糖酸鈉的生產方法主要包括均相化學氧化法、電解氧化法、多相催化氧化法、微生物發(fā)酵法和酶轉化法，而發(fā)酵法由于具有周期短、條件溫和、易于控制、環(huán)境友好、成本低等優(yōu)點，是目前工業(yè)生產葡萄糖酸鈉的主要方法[4-5]。近幾年，在高產菌株選育、發(fā)酵工藝控制、下游提取技術、節(jié)能減排、廢菌體及母液綜合利用等多個方面都取得了突破性進展，生產成本不斷降低，產品質量不斷提高，其新的用途也不斷被開發(fā)出來[4，6-9]。

發(fā)酵法生產葡萄糖酸鈉主要有霉菌發(fā)酵和細菌發(fā)酵，另外還有固定細胞發(fā)酵工藝，而目前工業(yè)生產上普遍采用的是黑曲霉菌發(fā)酵工藝[4，10-11]。該工藝采用的是液體深層通風攪拌發(fā)酵技術，以高濃度的玉米淀粉為原料，經過玉米淀粉水解糖的制備工藝，由黑曲霉將其轉化生產葡萄糖酸，同時在發(fā)酵過程中流加氫氧化鈉中和得到葡萄糖酸鈉，并控制適宜菌體生長和代謝的pH值。實現(xiàn)黑曲霉發(fā)酵高效生產葡萄糖酸鈉的關鍵環(huán)節(jié)一是生產菌株的高產性能；二是科學合理的培養(yǎng)基組成和過程控制；三是工程化裝備及過程的優(yōu)化組合。在發(fā)酵罐發(fā)酵過程中可以采用流加NaOH進行中和，葡萄糖酸鈉的溶解度高，對發(fā)酵不會產生影響，能進行葡萄糖酸鈉高濃度發(fā)酵的研究。因此，該實驗以一株耐高糖、耐高溫、代謝速率快的葡萄糖酸鈉生產菌株Aspergillus nigerSFGT601作為目標菌株，采用5 L全自動發(fā)酵罐對其發(fā)酵培養(yǎng)基組成及過程控制參數(shù)pH值和溶解氧進行了優(yōu)化研究，為進一步將其利用在大規(guī)模工業(yè)化生產中提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）SFGT601：山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室。

1.1.2 主要試劑

商品玉米淀粉：諸城興貿玉米開發(fā)有限公司；高溫α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶：諾維信生物技術有限公司；瓊脂：海南省青葛瓊脂廠；實驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（察氏瓊脂培養(yǎng)基）：蔗糖30 g/L，K2HPO41 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂20 g/L，0.1 MPa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖150 g/L（玉米淀粉雙酶水解糖），MgSO4·7H2O 1.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，玉米漿3.0 g/L，CaCO310 g/L，pH 6.0～6.5，0.1 MPa滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖250～350 g/L（玉米淀粉雙酶水解糖），MgSO4·7H2O 1.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，玉米漿3.0 g/L，pH 6.0～6.5，0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SBA-40C葡萄糖測定儀：山東省科學院生物研究所；THZ-C生化培養(yǎng)箱：江蘇太倉市實驗設備廠；PHS-3C型便攜式pH計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋：江蘇金壇縣國華儀器廠；YXQSG41280型蒸汽消毒器：無錫市第二醫(yī)療器械廠；JY2002型電子天平：梅特勒有限公司；5 L全自動發(fā)酵罐：無錫匯森生物設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米淀粉水解糖的制備[12]

將商品玉米淀粉和水按1∶2.5左右的比例混合，調節(jié)pH值在6.0～6.5，加入高溫淀粉酶，加酶量按10 U/g（干淀粉），100 ℃液化，液化DE值控制在15%～18%，然后用鹽酸調節(jié)pH值在4.5左右，冷卻至60 ℃加葡萄糖淀粉酶進行糖化，加酶量控制在120 U/g（干淀粉），糖化DE值控制在98%以上，升溫80 ℃滅酶10 min，用粉末活性炭30 ℃攪拌脫色30 min，過濾去除碳餅，獲得玉米淀粉水解糖，工藝過程如圖1。

圖1 玉米淀粉水解糖的制備工藝Fig.1 Preparation process of hydrolyzed corn starch sugar

1.3.2 分批發(fā)酵

首先將培養(yǎng)成熟的斜面種子接種一環(huán)至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min 發(fā)酵12 h，然后將種子液轉移至5 L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵實驗，發(fā)酵罐的填充系數(shù)控制在70%，接種量為10%，控制通風比1∶0.5～1∶1.0，罐壓0.1 MPa，發(fā)酵溫度40 ℃，流加氫氧化鈉控制pH 5.0～6.0，考查不同條件下菌株A.nigerSFGT601葡萄糖酸鈉發(fā)酵的情況。

1.3.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用單因素實驗，在保持培養(yǎng)基中其他成分不變的情況下，通過分別改變基礎培養(yǎng)基中初始碳源的質量濃度（葡萄糖240 g/L、260 g/L、280 g/L、300 g/L、320 g/L、340 g/L），氮源的質量濃度（玉米漿2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0 g/L、4.5 g/L；酵母膏0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L）以及金屬離子含量（MgSO4·7H2O，0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L），考察了培養(yǎng)基組分的質量濃度對菌株A.nigerSFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響。

1.3.4 工藝參數(shù)的優(yōu)化

1.3.5 分析方法

（1）總糖及還原糖的測定

總糖的測定采用快速滴定法[13]；還原糖的測定采用斐林試劑滴定法[13]。

（2）葡萄糖酸鈉的測定

葡萄糖酸鈉的測定采用標準曲線法[4，14]，在堿性條件下，葡萄糖酸與硫酸銅作用生產銅-葡萄糖酸鹽配合物，此溶液為透明均一的青藍色，在波長660 nm處測其吸光度值，繪制葡萄糖酸銅-吸光度值標準曲線，采用分光光度計法測定葡萄糖酸鈉的含量。

（3）葡萄糖含量的測定

采用SBA-40D生物傳感分析儀進行測量，將樣品稀釋一定的倍數(shù)，進樣量25 μL。

（4）轉化率的計算

作為力控末端執(zhí)行器的關鍵部件，恒力補償作動部件的動靜態(tài)特性對力控末端執(zhí)行器的綜合性能具有極大的影響，因此綜合采用機械、氣壓、液壓和電磁等多種驅動技術，研究出摩擦小、精度高、頻響高和柔性好的新型恒力補償作動部件至關重要。此外，為減小恒力補償作動部件的體積和質量，提高其可靠性和使用的方便性，可將相關機電液氣零部件進行高度集成設計，形成緊湊型復合作動部件。

式中：葡萄糖酸鈉產量，g/L；葡萄糖含量，g/L。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖質量濃度對黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響

由于生產葡萄糖酸鈉的黑曲霉菌株不能耐受較高濃度的酸，高濃度的酸對菌株的葡萄糖氧化酶具有抑制作用，而初始葡萄糖的質量濃度與黑曲霉產酸的含量是直接相關的，從而影響到菌株SFGT601葡萄糖酸鈉的產率和轉化率，選擇合適的葡萄糖質量濃度就尤為關鍵，因此本實驗考察了不同的起始葡萄糖質量濃度在同一時間（24 h）菌株SFGT601的發(fā)酵情況，結果見表1。

表1 起始葡萄糖含量對發(fā)酵結果的影響Table 1 Effect of initial glucose concentration on fermentation

由表1可知，在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，隨著葡萄糖質量濃度的增加，葡萄糖酸鈉的產量有明顯的上升，當葡萄糖的質量濃度為320 g/L時，葡萄糖酸鈉的產量達到310.8 g/L，殘?zhí)菫?3.6 g/L，繼續(xù)增加葡萄糖的濃度，葡萄糖酸鈉的產量增加緩慢，同時其轉化率也開始下降，殘?zhí)抢^續(xù)增加，發(fā)酵殘?zhí)堑拇嬖冢坏绊懺系睦寐剩矣绊懏a品提取回收過程母液的回用次數(shù)，導致母液排放量偏高和產品回收率下降。因此選擇控制葡萄糖起始質量濃度為320 g/L。

2.2 氮源含量對黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源包括玉米漿（3.0 g/L）和酵母膏（0.5 g/L）兩種，作為玉米加工副產物，玉米漿在發(fā)酵行業(yè)被廣泛應用，玉米漿中除含有豐富的含氮物質外，還富含磷元素和無機離子，如Ca2+、Mg2+等，而酵母粉中除含有豐富的含氮物質以外，還富含維生素，尤其是B族維生素，為菌株生長代謝提供輔酶等生長必需因子。本研究將葡萄糖的初始質量濃度控制在320 g/L，考察了玉米漿和酵母膏用量對菌株SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響，其結果見表2和表3所示。

表2 玉米漿添加量對發(fā)酵結果的影響Table 2 Effect of corn steep liquor concentration on fermentation

從表2可知，隨著玉米漿質量濃度的升高，葡萄糖酸鈉的產量出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當玉米漿添加量為3.5 g/L時，葡萄糖酸鈉產量達到最大值315.2 g/L，此時的發(fā)酵殘?zhí)菫?.5 g/L，繼續(xù)增加玉米漿的質量濃度，葡萄糖酸鈉的產量開始出現(xiàn)下降，轉化率也有所下降，殘?zhí)呛块_始上升，當提高至4.5 g/L時，殘?zhí)堑暮炕厣?7.0 g/L，因此玉米漿的適宜添加量為3.5 g/L。

表3 酵母膏添加量對發(fā)酵結果的影響Table 3 Effect of yeast extract addition on fermentation

由表3可知，隨著酵母膏添加量的增加，葡萄糖酸鈉的產量也是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，殘?zhí)鞘窍认陆岛笊仙斀湍父嗟奶砑恿繛?.0 g/L時，葡萄糖酸鈉產量達到最大值319.5 g/L，發(fā)酵殘?zhí)菫?.3 g/L，其后葡萄糖酸鈉產量下降，殘?zhí)巧仙斀湍父嗟奶砑恿枯^少時，轉化率變化不明顯，當超過2.0 g/L以后，轉化率有明顯的下降，所以酵母膏的適宜添加量為2.0 g/L。

2.3 硫酸鎂質量濃度對黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響

葡萄糖酸鈉發(fā)酵主要涉及到磷酸戊糖途徑，鎂除了組成某些細胞的葉綠素成分外并不參與細胞的組成，但它的離子狀態(tài)是許多重要酶的激活劑，影響著基質的氧化和蛋白的合成等。本研究考察了鎂離子對葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響。固定發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變（葡萄糖320 g/L，玉米漿3.5 g/L，酵母膏2.0 g/L），調整培養(yǎng)基中硫酸鎂的質量濃度，其在5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵結果見表4所示。

表4 硫酸鎂對發(fā)酵結果的影響Table 4 Effect of magnesium sulfate concentration on fermentation

由表4可知，隨著培養(yǎng)基中鎂離子含量的增加，葡萄糖酸鈉的產量起初有所上升，轉化率也有所提高，殘?zhí)且泊罅肯陆担斊涮砑恿繛?.5 g/L時，葡萄糖酸鈉的產量達到最大值322.5 g/L，轉化率也達到最大值101.8%，再繼續(xù)增加其用量，葡萄糖酸鈉產量和轉化率都有少量下降，殘?zhí)且灿猩倭吭黾樱虼俗钸m宜的MgSO4·7H2O添加量為1.5 g/L。

2.4 培養(yǎng)基pH值對黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響

根據(jù)黑曲霉生長與產物葡萄糖酸生成的關系分析，屬于菌體生長和產物生成部分偶聯(lián)型，在菌株生長階段就伴隨著葡萄糖酸的生成，體系的pH值迅速下降，由于產葡萄糖酸鈉的黑曲霉不能耐受高濃度的葡萄糖酸，為保證菌株的正常生長和代謝，需要流加氫氧化鈉溶液控制pH值。考慮到菌體生長和產物合成兩個過程的最適pH值是存在差異的，實驗利用5 L全自動發(fā)酵罐pH值在線檢測系統(tǒng)對葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程進行實時檢測，并通過流加氫氧化鈉溶液控制不同的pH值，結果如圖2所示。

圖2 pH對菌株SFGT601葡萄糖酸鈉產量(A)和葡萄糖質量濃度(B)的影響Fig.2 Effect of pH on sodium gluconate production (A) and glucose concentration (B) by strain SFGT601 fermentation

由圖2可知，當控制發(fā)酵液的pH值5.0時，發(fā)酵初期葡萄糖的消耗速度較慢，發(fā)酵周期明顯延長（28 h），但是發(fā)酵結束時葡萄糖酸鈉的產量較高（323.8 g/L）；當控制pH值6.0時，菌株較快的進入主發(fā)酵期，耗糖速度較快，發(fā)酵周期縮短為22 h，但是葡萄糖酸鈉的產量很低（307.0 g/L）；當將pH值調整為5.5時，發(fā)酵周期為24 h，葡萄糖酸鈉的產量為318.0 g/L，處于一個相對高的水平，因此綜合考慮采取兩段pH控制策略，其結果如圖3所示。

圖3 兩段pH控制策略對發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of two-stage pH control strategy on fermentation

由圖3可知，在菌株生長階段（0～8 h），控制pH值5.5～6.0菌株耗糖速率相對較快，最有利于菌體生長，可以有效縮短菌體生長時間；而進入產酸階段，控制pH值5.0～5.5則代謝速率和耗糖最快，發(fā)酵結束時，葡萄糖酸鈉的產量達到322.5 g/L。因此，葡萄糖酸鈉發(fā)酵理想的pH值控制策略是：發(fā)酵初期（0～8 h），控制pH值5.5～6.0，進入主發(fā)酵期后（8 h以后），控制pH值5.0～5.5，24 h時發(fā)酵結束。

2.5 溶解氧對黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響[15]

圖4 溶解氧濃度對菌株SFGT601葡萄糖酸鈉產量(A)和葡萄糖質量濃度(B)的影響Fig.4 Effect of dissolved oxygen concentration on sodium gluconate production (A) and glucose concentration (B)by strain SFGT601 fermentation

葡萄糖酸鈉發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，氧不僅參與黑曲霉的生長繁殖，還是葡萄糖轉化生成葡萄糖酸的原料之一，因此溶解氧濃度是葡萄糖酸鈉高效發(fā)酵的重要參數(shù)之一。本實驗采用溶解氧（dissolved oxygen，DO）在線檢測系統(tǒng)對葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程進行實時檢測，溶解氧電極分別在飽和亞硫酸鈉溶液和培養(yǎng)基接種前、最大溶解氧條件下校準為0點和100%，在發(fā)酵過程中隨著溶解氧濃度的降低，通過調整通風量和攪拌轉速控制不同的溶解氧濃度，考察其對黑曲霉SFGT601葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響，結果見圖4所示。

由圖4可知，通過控制攪拌轉速和通風量，當維持發(fā)酵液中的溶解氧濃度在20%左右，發(fā)酵結果最好，此時的葡萄糖酸鈉的產量達到最大值324.5 g/L，且發(fā)酵速率較快，發(fā)酵周期為24 h；當溶解氧濃度低于或高于20%時，葡萄糖酸鈉的產量都略有下降，并且溶解氧濃度為10%時耗糖速率減緩，發(fā)酵周期延長（26 h），進而導致發(fā)酵成本的增加；而當溶解氧濃度為30%時，由于氧氣的供給大于菌株的需求，菌株大量生長增加呼吸作用消耗的底物，從而導致葡萄糖酸鈉的產量有所下降，雖然發(fā)酵周期略有縮短，但是轉速和通風量的增加也會相應的導致耗能的增加，因此綜合考慮控制發(fā)酵液中溶解氧濃度為20%。

2.6 優(yōu)化后的葡萄糖酸鈉發(fā)酵進程曲線

經過上述的對菌株SFGT601的培養(yǎng)基和工藝參數(shù)的優(yōu)化，得到了最佳的葡萄糖酸鈉發(fā)酵工藝條件，在5 L發(fā)酵罐中進行了發(fā)酵驗證實驗，其結果如圖5所示。

圖5 優(yōu)化后黑曲霉SFGT601產葡萄糖酸鈉發(fā)酵進程曲線Fig.5 Fermentation process curve of sodium gluconate-producing Aspergillus niger SFGT601 fermentation at the optimized condition

由圖5可知，接種后發(fā)酵罐中溶解氧迅速下降，4 h時溶解氧開始低于20%，此時開始調整轉速和通風量保持DO=20%，此時耗糖速率和產物合成速率加快；2 h時pH值開始出現(xiàn)下降，為了保持菌株的生長和代謝流加NaOH溶液控制pH值，0～8 h控制pH值5.5～6.0，8 h進入主發(fā)酵期后控制pH值5.0～5.5，22 h時葡萄糖的含量降為零，發(fā)酵結束，此時葡萄糖酸鈉的產量達到最大值326.0 g/L。

3 結論

對起始葡萄糖質量濃度、玉米漿、酵母粉、硫酸鎂等主要培養(yǎng)基組分以及pH值、溶解氧等因素對黑曲霉SFGT601葡萄糖酸鈉發(fā)酵的影響進行了優(yōu)化研究，確定了黑曲霉SFGT601葡萄糖酸鈉發(fā)酵的較優(yōu)培養(yǎng)基組成和控制條件。最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖質量濃度320 g/L，玉米漿3.5 g/L，酵母膏2.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L。最優(yōu)控制條件為溶解氧20%，0～8 h控制pH值5.5～6.0，8～22 h控制pH值5.0～5.5。在此工藝條件下，葡萄糖酸鈉的產量為326.0 g/L，發(fā)酵周期縮短為22 h。

[1]王博彥，金其榮.發(fā)酵有機酸生產與應用[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[2]馬保國，李高明，李相國，等.葡萄糖酸鈉與聚羧酸減水劑的復合效應研究[J].武漢理工大學學報，2011，33（1）：52-55.

[3]韓延雷，范宜曉，趙 晨，等.中國葡萄糖酸鈉行業(yè)市場及發(fā)展[J].山東食品發(fā)酵，2013（3）：1-3.

[4]張 靜.黑曲霉發(fā)酵生產葡萄糖酸鈉的研究[D].無錫：江南大學碩士論文，2008.

[5]黃騰華.葡萄糖酸鈣和葡萄糖酸鈉發(fā)酵[J].發(fā)酵科技通訊，2006，35（7）：22-23.

[6]馮 芳，趙 偉，孫姍姍.高通量篩選葡萄糖酸鈣高產菌株[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（12）：74-77.

[7]蔡 皓，余 超，李 慶.黑曲霉葡萄糖酸發(fā)酵的工藝控制方法[J].化學與生物工程，2008，25（6）：63-66.

[8]陳 芬.發(fā)酵法生產葡萄糖酸鈉工藝的優(yōu)化[J].武漢紡織大學學報，2013，26（6）：27-31.

[9]汪 炯.葡萄糖酸以及葡萄糖酸內酯制備工藝研究[D].廣州：暨南大學碩士論文，2012.

[10]SANKPAL N V,KULKARNI B D.Optimization of fermentation conditions for gluconic acid production usingAspergillus nigerimmobilized on cellulose microfibrils[J].Process Biochem,2002,12(37):1343-1350.

[11]RAO D S,PANDA T.Comparative analysis of different whole cell immobilisedAspergillus nigercatalysts for gluconic acid fermentation using pretreated Indian cane molasses[J].Bioprocess Eng,1994,11(5):209-212.

[12]劉建軍.衣康酸發(fā)酵的研究[D].天津：天津科技大學博士論文，2003.

[13]張龍翔.生化實驗方法和技術[M].北京：人民教育出版社，1997.

[14]李 艷，肖凱軍，王兆梅，等.葡萄糖酸鈉檢測方法研究[J].食品研究與開發(fā)，2006，27（6）：109-112.

[15]郭茸愷，王澤建，莊應萍，等.葡萄糖酸鈉發(fā)酵中底物-產物作用對氧傳遞的影響及發(fā)酵過程優(yōu)[J].安徽農業(yè)科學，2012，40（22）：11151-11198.