響應(yīng)面法優(yōu)化航天紫花苜蓿中葉蛋白的提取工藝

潘衛(wèi)倉(cāng)

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

紫花苜蓿（Medicago sativaLinn）又名苜蓿、紫苜蓿，是豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生宿根性草本植物，具有一次種植、常年收獲，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好等突出特點(diǎn)，且該植物枝葉繁茂、莖葉柔軟、適口性好，是世界上最重要的栽培牧草，被譽(yù)為“牧草之王”[1-3]。紫花苜蓿在世界上主要分布在歐洲、亞洲和非洲，在我國(guó)廣泛分布在華北、西北、黃淮海、東北南部地區(qū)。近年來，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的大力調(diào)整，我國(guó)苜蓿的種植面積也大大增加，現(xiàn)在栽培面積約有188萬公頃[4-6]。

紫花苜蓿含有多種化學(xué)成分，如葉蛋白、揮發(fā)油、皂苷類、黃酮類等，粗蛋白含量通常在22%左右，含有20種以上的氨基酸。具有產(chǎn)量高和營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)牧草，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，各種家畜都喜歡食用，飼喂奶牛效果尤佳[7-8]。航天育種（或太空育種）又稱空間誘變育種，具有變異頻率高、變異幅度大、有益變異多、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)勢(shì)明顯。近年來研究表明，經(jīng)空間搭載后，紫花苜蓿當(dāng)代植株初級(jí)分枝數(shù)和單株生物量均顯著增加，莖粗無顯著變化，各種主要成分含量較之普通苜蓿有顯著變化。本試驗(yàn)采用葉蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取提取液pH值、提取溫度、料液比、浸泡時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)[9-11]，首先以單因素試驗(yàn)確定各個(gè)因素的水平值，然后進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而優(yōu)選建立了航天紫花苜蓿中葉蛋白的最佳提取工藝條件。以期為航天紫花苜蓿資源的深層次開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

航天紫花苜蓿：采自天水市國(guó)家級(jí)高新農(nóng)業(yè)園區(qū)神州綠鵬航天育種基地，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所趙強(qiáng)研究員鑒定為豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生宿根性草本植物紫花苜蓿。干燥、粉碎、過篩。

磷酸氫二鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：開封化學(xué)試劑總廠；硫酸銨：金山化工廠；牛血清白蛋白：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-9200型紫外分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器公司；AUY220電子天平：日本島津公司；HJ-3型恒溫磁力攪拌器：金壇市科興儀器廠；PHS-3D型精密PH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-W型多管架自動(dòng)平衡離心、TG16-W型微量高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AUY220型電子天平、DK-8AD型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-S24型漩渦混合器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及曲線繪制

準(zhǔn)確稱取50.00 mg牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，采用去離子水定容至50.00 mL，配制成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL、0.70mg/mL、0.80mg/mL、0.90 mg/mL。以去離子水為參比，在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定其吸光度值，以牛血清白蛋白的含量（x）為橫坐標(biāo)，OD280nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 航天紫花苜蓿中葉蛋白樣液制備

準(zhǔn)確稱取航天紫花苜蓿5.00 g，加入石英砂研磨，加入不同pH值的緩沖液[12]，調(diào)節(jié)pH值為7.0，在設(shè)定的溫度條件下浸泡一段時(shí)間后，將混合物轉(zhuǎn)移至離心管中，利用多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，再取上清液于2個(gè)5 mL離心管中，然后利用微量高速離心機(jī)離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min。將上清液轉(zhuǎn)入另兩個(gè)離心管中，采用不同飽合度的硫酸銨分級(jí)分離苜蓿葉蛋白，每次所得蛋白再溶解后合并至同一離心管中，總體積為4 mL，吸取0.4 mL至離心管中，再加入pH值為7.0的緩沖液3.6 mL，搖勻、靜置待測(cè)定。

1.3.3 航天紫花苜蓿中葉蛋白提取工藝的建立

選取提取液pH值、提取溫度、料液比、浸泡時(shí)間4個(gè)因素依次進(jìn)行單因素輪換提取苜蓿葉蛋白提試驗(yàn)，各因素的水平梯度設(shè)置分別為提取液pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，提取溫度10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃，料液比1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g∶mL）、浸泡時(shí)間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h。按照航天紫花苜蓿中葉蛋白樣液的制備的方法逐一進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度值，對(duì)照牛血清白蛋白工作曲線，計(jì)算航天紫花苜蓿中葉蛋白提取率，確定各個(gè)因素的水平，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而建立航天紫花苜蓿中葉蛋白提取的工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的梯度溶液在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度值，繪制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of bovine serum albumin

由圖1可知，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.508 2x+0.283 8，R2=0.999 3（n=9），牛血清白蛋白在0～1.00 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 pH值對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白提取率的影響

圖2 不同pH值對(duì)葉蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on leaf protein extraction ratio

由圖2可知，航天紫花苜蓿葉蛋白的提取率在pH值為5.0、6.0和7.0時(shí)的提取率較高，pH值為6.0時(shí)提取率最高，且提取得到的航天紫花苜葉蛋白含的雜質(zhì)比較少，故提取液的pH值為6.0時(shí)提取效果較好。

2.2.2 溫度對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白提取率的影響

圖3 浸泡溫度對(duì)葉蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of macerating temperature on leaf protein extraction ratio

由圖3可知，溫度對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白提取率的影響不是很顯著，在25 ℃時(shí)提取率最高，所以一般選擇室溫即可進(jìn)行航天紫花苜蓿葉蛋白的提取；并且加熱需要耗能，會(huì)增加試驗(yàn)的成本，因此一般在室溫條件下進(jìn)行即可。

2.2.3 料液比對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白提取率的影響

圖4 液料比對(duì)葉蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on leaf protein extraction ratio

由圖4可知，料液比對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白的提取的影響是比較顯著的，航天紫花苜蓿葉蛋白的提取率在料液比為1∶8（g∶mL）時(shí)最大，并且隨著料液比增大提取率不再增加，緩沖液加入太少，航天紫花苜蓿葉蛋白則不能充分溶解，加緩沖液加入太多，又會(huì)增加提取體積，降低生產(chǎn)效率，因此料液比為1∶8（g∶mL）時(shí)最佳。

2.2.4 浸泡時(shí)間對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白提取率的影響

圖5 浸泡時(shí)間對(duì)葉蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of macerating time on leaf protein extraction ratio

由圖5可知，浸泡時(shí)間對(duì)航天紫花苜蓿葉蛋白的提取具有較大的影響，浸泡時(shí)間比較短的時(shí)候，提取率比較低，這是由于提取液尚未完全將葉蛋白溶出；在浸泡時(shí)間為2.0 h時(shí)航天紫花苜蓿葉蛋白的提取率最高，當(dāng)浸泡時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，提取率又變得很低，這是由于長(zhǎng)時(shí)間的浸泡，提取液不但將葉蛋白溶出，并且還會(huì)將其他的一些物質(zhì)溶出，進(jìn)而導(dǎo)致葉蛋白的提取率降低，因此選擇浸泡時(shí)間為2.0 h是較為理想的。

2.3 航天紫花苜蓿葉蛋白響應(yīng)面法提取工藝的建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取液pH值、提取溫度、料液比、浸泡時(shí)間4個(gè)因素為考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，使用Design-Expert 7.5軟件，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以航天紫花苜提取率蓿葉蛋白的提取率為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析（response surface analysis，RSA）試驗(yàn)。設(shè)計(jì)4因素3水平（共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，其因素水平表如表1所示[13-15]。

表1 葉蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for leaf protein extraction conditions optimization

以A（料液比）、B（提取液pH值）、C（浸泡時(shí)間）、D（提取溫度）為自變量，以航天紫花苜提取率蓿葉蛋白的提取率為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共有29個(gè)試驗(yàn)，其中24組試驗(yàn)為析因試驗(yàn)，5組試驗(yàn)為中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)的誤差，其結(jié)果見表2所示，試驗(yàn)的模型方差分析結(jié)果見表3所示。

表2 葉蛋白提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface methodology for leaf protein extraction conditions optimization

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，并做重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果采用軟件Design-Expert 7.0進(jìn)行響應(yīng)面分析，經(jīng)二次回歸擬合后，得到4個(gè)因素與航天紫花苜蓿葉蛋白提取率之間的模擬方程為：

由表3可知，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型的F檢驗(yàn)為極顯著（P＜0.01），而失擬項(xiàng)同樣達(dá)到極顯著（P＜0.01）水平，其決定系數(shù)R2=0.901 2，表明試驗(yàn)?zāi)M與實(shí)際接近，且誤差較小，能反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。其影響非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其中A、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），B、AC呈顯著影響（P＜0.05）。

2.4 響應(yīng)面分析

考察各因素之間相互關(guān)系對(duì)葉蛋白提取率影響，從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形可知，曲線走勢(shì)的陡峭程度，決定其影響的顯著程度，響應(yīng)趨勢(shì)線見圖6所示。

從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，其影響越小。航天紫花苜蓿中葉蛋白提取過程中，液料比、提取液pH值、浸泡時(shí)間和提取溫度的圖形曲線走勢(shì)較陡，說明其影響最為顯著。由Design-Expert 7.5軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，模擬得到航天紫花苜蓿中葉蛋白的最佳提取工藝條件為料液比1∶8.14（g∶mL）、提取液pH 6.13、浸泡時(shí)間2.02 h、提取溫度為25.15 ℃，葉蛋白的提取率為14.021 6%，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)過程的局限性，最終確定修正后的工藝條件為料液比1∶8（g∶mL）、提取液pH 6.1、浸泡時(shí)間2.0 h、提取溫度25.0 ℃，此工藝條件下航天紫花苜蓿葉蛋白的提取率為14.023 8%。

圖6 料液比、提取液pH、浸泡時(shí)間、提取溫度的交互作用對(duì)葉蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effect of interactions of liquid solid ratio,macerating time and temperature on leaf protein extraction rate

3 結(jié)論

空間誘變育種技術(shù)是航天技術(shù)、生物技術(shù)和農(nóng)業(yè)育種技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。紫花苜蓿通過航天誘變，其營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生改變，葉蛋白含量是苜蓿營(yíng)養(yǎng)成分的主要指標(biāo)之一，測(cè)定其含量變化，有利于進(jìn)一步開發(fā)研究其在畜禽飼糧中的應(yīng)用。在響應(yīng)面提取試驗(yàn)中，提取溫度并不是影響試驗(yàn)結(jié)果的最大因素，而料液比和提取液的pH值則是影響比較顯著，說明在各因素共同作用時(shí)，與單因素的情況不同，具有一定的協(xié)同效應(yīng)。航天紫花苜蓿為甘肅省特色飼用植物，其中葉蛋白含量較高，本試驗(yàn)采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，不但克服了正交設(shè)計(jì)的缺陷，而且減少試驗(yàn)次數(shù)；同時(shí)還能分析幾種因素間的交互作用，從而更為全面地反映各因素水平的效果[16-22]。響應(yīng)面法建立的航天紫花苜蓿中葉蛋白提取工藝條件為料液比1∶8（g∶mL）、提取液pH值6.1、浸泡時(shí)間2.0 h、提取溫度25.0 ℃，在此條件下，航天紫花苜蓿葉蛋白的提取率為14.023 8%。通過以上研究，為今后我國(guó)航天紫花苜蓿資源的深層次開發(fā)和利用提供一定的理論參考。

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