一株產殼聚糖酶芽孢桿菌的分離及鑒定

虞鳳慧，徐澤平,2 *，謝海濤

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.濱州市環境微生物技術工程研究中心，山東 濱州 256500）

殼聚糖是由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖胺（GlcN）通過β-（1-4）-糖苷鍵相連接的多糖[1-3]，它是甲殼素脫乙酰基的產物[4-6]。殼聚糖酶（chitosanase，EC3.2.1.99）是一種可專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶[7]，可以選擇性地、特異性地切斷殼聚糖的β-（1-4）-糖苷鍵，得到特異分子量范圍的殼寡糖[8]。殼寡糖是目前僅知的唯一的堿性寡糖[9]，具有獨特的生物活性[10-12]，在醫藥、飼料、農業、環保、食品等領域具有廣泛的應用[13-16]。隨著殼寡糖的酶法制備工藝的深入研究，殼聚糖酶的生產及應用研究引起了國內外學者的廣泛關注，成為目前的研究熱點之一。

殼聚糖酶主要分布于細菌[17]、真菌[18]、病毒等微生物中。目前已報道有多種來源的菌株具有產生殼聚糖酶的能力，但已分離出的殼聚糖酶酶活力不高，使用效率較低，進而使其制備殼寡糖的工業化生產成本一直居高不下。因此，開發高活力、高產的殼聚糖酶工業化生產菌株資源意義重大。本研究擬從黃河三角洲地區的腐敗落葉中分離出一株高產殼聚糖酶的芽孢桿菌菌株，通過形態學特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對該菌株進行分離、鑒定，以期為殼聚糖酶生產和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗落葉：取自黃河三角洲地區；水溶性殼聚糖（脫乙酰度＞90%）：浙江金殼制品有限公司；其余試劑均為國產分析純。

初篩培養基：水溶性殼聚糖1.5%，硫酸銨0.5%，酵母浸粉0.5%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二鉀0.07%，七水硫酸鎂0.005%，瓊脂粉1.6%，pH 7.0。

種子培養基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，葡萄糖1%，pH 7.0。

液體發酵（復篩）培養基：水溶性殼聚糖1.5%，硫酸銨0.5%，酵母浸粉0.5%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二鉀0.07%，七水硫酸鎂0.005%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.2%，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

DL-5型低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；VORTEX-5旋渦混和器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HZQ-Q全溫振蕩培養箱：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；FA2004型電子天平：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖酶產生菌的篩選

（1）殼聚糖酶產生菌的初篩

稱取粉碎的腐敗落葉10 g，加入90 mL 無菌水中，振蕩30 min，使樣品與水充分混合，取混合液依次稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7等不同的稀釋度，將稀釋液涂布于初篩培養基上，33 ℃培養2～5 d，觀察初篩培養基上菌落周圍有無透明圈出現。以透明圈直徑與菌落直徑比值的大小作為篩選產殼聚糖酶菌株的指標，并進行分離純化。

（2）殼聚糖酶產生菌的分離純化

將分離的菌株接入種子培養基中，33 ℃、150 r/min振蕩培養2 d后，用接種環取少量菌液接入營養瓊脂培養基，采用平板劃線分離法對菌株進行純化，33 ℃培養2 d后，取單菌落接入斜面培養基中進行純培養，備用。

（3）殼聚糖酶產生菌的復篩

種子培養：無菌條件下，取新鮮的斜面保藏菌種1～3環于種子培養基中，在33 ℃、150 r/min條件下搖瓶培養12～18 h，即為種子液。

液體發酵培養：無菌條件下，按5%的接種量，將種子液轉接至液體發酵培養基中，33 ℃、150 r/min條件下搖瓶培養2 d，發酵液經4 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為殼聚糖酶粗酶液，4 ℃保存備用。

（4）殼聚糖酶活性測定

采用DNS法[19]。

酶活定義：50 ℃條件下，1 mL液體酶每分鐘催化產生1 μmol還原糖所需的酶量，即為一個酶活力單位，U/mL。

1.3.2 菌種鑒定

菌體形態觀察：將分離純化的產殼聚糖酶菌種接種于營養瓊脂平板上，33 ℃培養24 h，觀察菌體形態及菌落特征；接種于種子培養基中，33 ℃、150 r/min搖瓶培養12 h，進行革蘭氏染色[20]。

生理生化試驗：糖類發酵試驗、V.P.試驗、甲基紅（methyl red，MR）試驗、過氧化氫酶定性試驗、生長溫度的測定、酪氨酸水解試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]方法進行。

16SrDNA序列分析：提取菌種的總DNA，進行16S rDNA的PCR擴增及序列測定，將16S rDNA測序結果在GenBank的核酸數據中進行同源性比對、分析。由中美泰和生物技術（北京）有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶產生菌的篩選及酶活測定

通過菌種初篩，從黃河三角洲地區的腐敗落葉中分離出9株產殼聚糖酶菌株，再經分離純化和復篩，獲得了1株產殼聚糖酶酶活最高的菌株，命名為XHT-0903，該菌株液體發酵酶活力達20 U/mL。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌落及形態特征

菌株XHT-0903該菌株在營養瓊脂平板上菌落呈圓形凸起，表面粗糙有蠟光，不透明，無色素，白色，似毛玻璃（如圖1所示）。菌落直徑約6 mm。

圖1 XHT-0903菌株的菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strain XHT-0903

革蘭氏染色時菌體被均勻的染成藍紫色，為革蘭氏陽性菌。菌體形狀為桿狀，兩端鈍圓，且呈短鏈桿狀排列，菌體大（如圖2所示）。培養6 h后可形成芽孢，芽孢圓形，小于菌體。參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》，初步確定該菌株屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖2 XHT-0903菌株的光學顯微鏡圖Fig.2 Optical micrograph of strain XHT-0903

2.2.2 生理生化特征

生理生化鑒別試驗結果見表1。由表1可知，菌株XHT-0903能利用葡萄糖和乳糖；能水解酪氨酸和淀粉，其中在含有L-酪氨酸的培養基上培養至14 d時，酪氨酸結晶已經完全被水解而變為透明；V.P.試驗、甲基紅（MR）試驗、過氧化氫酶試驗和吲哚試驗均呈陽性；生長溫度試驗顯示，XHT-0903生長溫度范圍為15～45 ℃，最適溫度為30～45 ℃。

根據上述形態學及生理生化特性研究，將菌株XHT-0903初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

表1 XHT-0903菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characterizations of strain XHT-0903

2.2.3 16S rDNA序列分析結果

PCR產物測序結果表明，測序片斷長1 402 bp。將該序列登錄到GenBank，登錄號為HM358155。采用NCBI中的Blast軟件，將測得的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的核酸數據進行同源性比對。結果表明，該序列與數據庫中的Bacillus屬的不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，與其中5株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）菌株有100%的同源性。采用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹，如圖3所示。結合形態學特征及生理生化特性，進一步確定XHT-0903菌株為蠟樣芽孢桿菌。該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4032。

圖3 XHT-0903菌株的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain XHT-0903

3 結論

本研究分離出一株殼聚糖酶高產菌株XHT-0903，通過形態學、生理生化特性及16S rDNA序列分析，確定為蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。相比已報道的產殼聚糖酶菌株，菌株XHT-0903具有產酶酶活高的優點，為高活力、高產的殼聚糖酶工業化生產菌株資源的開發奠定了基礎。本研究下一步將進行XHT-0903的固體發酵、產酶條件的優化、殼聚糖酶解工藝等研究，以期為殼聚糖酶的工業化生產及應用提供參考。

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