乳酸菌和酵母菌共酵改善食醋品質的研究

蔣 忠，馮文利，王 偉，崔芳芳，卞璨慧

（濟南德馨齋食品有限公司，山東 濟南 250100）

醋酸是釀造食醋中有機酸的主要成分，與其他有機酸、糖分、氨基酸、酯、醛、醇、酚、酮類等微量化學成分形成食醋特有的色、香、味。而它們含量的高低以及比例關系直接影響到食醋的品質[1]。有機酸是原料中淀粉、蛋白質和脂肪等物質在釀造過程中轉化生成的。食醋中的糖類以葡萄糖、麥芽糖和果糖為主，其主要來源于多糖的水解，糖類能調和食醋口感，提高色澤和稠厚度。食醋中含有18種氨基酸，其中有8種人體必需氨基酸，其來源于蛋白質水解和微生物菌體自溶，各種氨基酸呈味不同，能調和產品滋味，增加產品色澤和香氣，改善產品特性。氨基酸與糖類加熱發生羰基反應，生成色素、香氣成分和功能性物質[2]。

單純的醋酸具有刺激性嗅味、回味不長及調味差等缺點。只有多種有機酸如乳酸、檸檬酸、琥珀酸和蘋果酸等不揮發酸存在，才能使食醋酸味綿長、柔和可口，具有增進食欲、幫助消化的作用[2]。乳酸作為食醋中含量僅次于醋酸的一種有機酸，其不僅是食醋中不揮發酸的重要組成成分，也是食醋的重要呈味物質。在食醋生產的酒精發酵階段酵母發酵過程中接入乳酸菌，在無氧條件下葡萄糖發酵過程中間產物丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下會轉化生成乳酸[3]。這樣不但能增加食醋中乳酸等不揮發酸含量，而且為形成食醋中的香氣主要成分——乳酸乙酯創造有利條件[4]。不揮發酸含量高的食醋刺激性小，能調和酸味，使食醋口感柔和；而酯類多數是具有芳香氣味的揮發性化合物，是食醋香氣的主要組成部分。此外乳酸菌還具有蛋白分解酶，能分解蛋白質為短肽和氨基酸，從而使香味更加醇和[5]。

在液態深層制醋的發酵工藝中的酒精發酵階段和醋酸發酵階段均為單一菌種參與發酵過程，且發酵周期較短，不利于芳香物質的形成。雖然最終產酸較高，但其香氣成分含量較低[4]，致使液態發酵食醋的酸味不柔和，風味和口感較差。為了改善液醋的風味，提高食醋品質，科研人員已進行了大量的研究工作，提出了很多改進方法和解決措施并取得了一定的效果[6-10]。本研究在液醋的酒精發酵階段接種酵母菌的同時接入乳酸菌，并在單因素的基礎上通過正交試驗優化了其酒精發酵工藝條件，采用乳酸菌與酵母菌共酵的方法最終提高液醋的不揮發酸及酯類含量，以期達到改善液醋感官品質的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃河大米：市售；酵母菌：安琪公司釀酒活性干酵母；乳酸菌、滬釀1.01醋酸菌：德馨齋微生物實驗室保藏；α-淀粉酶（40 000 U/mL）、糖化酶（100 000 U/mL）：山東隆大生物工程有限公司；試驗中所用試劑均為國產分析純。

乳酸菌培養基[11]：葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨1%，乙酸鈉0.5‰，MgSO4·7H2O 0.2‰，MnSO4·4H2O 0.01‰，FeSO4·7H2O 0.01‰，NaCl 0.01‰，pH 7.0，115 ℃滅菌20～30 min。

醋酸菌培養基[12]：葡萄糖1%，酵母膏1%，121 ℃滅菌30 min，溫度降至70 ℃時加入5%的體積分數為95%的酒精。

1.2 儀器與設備

ZDX-35BI高壓滅菌鍋：上海精密儀器儀表有限公司；FA2004B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；78-1型恒溫培養箱：湖北黃石市醫療器械廠；pHS-3C型數顯酸度計；50 L深層液醋發酵罐：濟南市槐蔭區食品釀造機械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

操作要點：

浸米及磨漿：先將大米在清水中浸泡15 h，再把米與水以1∶6（g∶mL）的比例均勻放入鋼磨中，磨成細度為40目以上的米漿。

液化：米漿中按照10 U/g大米的添加量加入α-淀粉酶，并加入0.2%CaCl2以保護α-淀粉酶，提高其熱穩定性。升溫至95 ℃并維持60 min，至碘反應結束。再升溫至100 ℃并維持10 min，以達到滅菌的目的。

糖化：當液化醪降溫至60 ℃時，按照150 U/g大米的添加量加入糖化酶，恒溫60 ℃并維持3～4 h。

酵母活化[13]：在干酵母量的15～20倍33～35 ℃的溫水中加入活性干酵母溶解活化30 min。

乳酸菌活化[10]：接種乳酸菌于培養基中，置于30 ℃恒溫靜置培養2 d。離心沉淀菌體，將上清液除去，換入新鮮培養基繼續培養2 d。活化2次后備用。

酒精發酵：當糖化醪降溫至30 ℃時添加活化好的酵母菌和乳酸菌，攪拌均勻后置于恒溫30 ℃進行酒精發酵。

醋酸發酵：將酒精發酵結束后的酒醪經板框壓濾機過濾后加入液態深層醋酸發酵罐中，并以10%接種量接入擴培后的醋酸種子液進行醋酸發酵。發酵溫度30～32 ℃，發酵初期通風比1∶0.08，待凈增酸達到1 g/100 mL以后，調整通風比為1∶0.10～1∶0.15。醋酸發酵開始30 min后取發酵醪檢測總酸含量，此后每隔2 h檢測總酸含量，待發酵接近終點每隔30 min檢測總酸含量，連續3次檢測總酸含量無變化時，加入1%NaCl終止醋酸發酵。

后處理：將常溫陳釀30 d的食醋經硅藻土板框壓濾機過濾后，加熱至85 ℃滅菌，冷卻至常溫即為成品。

1.3.2 單因素試驗

酵母菌接種量的確定：按酵母菌接種量分別為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰，乳酸菌接種量6%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發酵3 d，考察酵母菌接種量對發酵液酒精度及乳酸含量的影響。

乳酸菌接種量的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發酵3 d，考察乳酸菌接種量對發酵液酒精度及乳酸含量的影響。

發酵溫度的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量6%于糖化醪中，分別置于26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃發酵3 d，考察發酵溫度對發酵液酒精度及乳酸含量的影響。

發酵時間的確定：按酵母菌接種量1‰，乳酸菌接種量分別為6%于糖化醪中，置于30 ℃恒溫發酵，分別在發酵24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h后，考察發酵時間對發酵液酒精度及乳酸含量的影響

1.3.3 正交試驗優化乳酸菌和酵母菌共發酵工藝條件

在單因素試驗的基礎上，設計4因素3水平正交試驗，考察酵母菌接種量、乳酸菌接種量、發酵溫度和時間4因素對發酵液酒精發酵階段酒精度和乳酸含量的影響。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

1.3.4 理化指標和衛生指標檢測方法

酒精度檢測采用國標GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》中的比重計法；總酸檢測采用國標GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》中的方法；不揮發酸檢測采用國標GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法；可溶性無鹽固形物采用國標GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法。乳酸檢測采用國標GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中總酸的方法；總酯檢測采用國標GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的電位滴定法。衛生指標檢測方法采用國標GB/T 4789.22—2003《食品衛生微生物學檢驗調味品檢驗》中的方法。

1.3.5 感官評價

選取國家調味品評審委員在內的9位專業人員從色澤、香氣、滋味和體態等4個方面對食醋樣品進行感官評分，滿分100分，具體評分標準見表2。

表2 食醋感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of vinegar

2 結果與分析

2.1 酵母菌接種量對發酵液酒精度和乳酸含量的影響

酵母菌接種量對發酵液酒精度和乳酸含量的影響結果如圖1所示。

圖1 酵母接種量對酒精度和乳酸含量的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and lactic acid content

由圖1可知，酵母菌接種量對發酵液酒精度和乳酸含量的影響比較明顯。隨著酵母菌接種量的提高，酒精度和乳酸含量均先增加后平穩下降。當酵母菌接種量為1.0‰時，二者數值達到最高值，分別為6.8%vol和0.50 g/100 mL，因此選擇酵母菌接種量1‰為宜。

2.2 乳酸菌接種量對酒度和乳酸含量的影響

乳酸菌接種量對發酵液酒精度和乳酸含量的影響結果如圖2所示。

圖2 乳酸菌接種量對酒精度和乳酸含量的影響Fig.2 Effect of lactic acid bacteria inoculum on alcohol content and lactic acid content

由圖2可知，乳酸菌接種量對發酵液酒精度和乳酸含量的影響不是很明顯。隨著乳酸菌接種量的提高，酒精度和乳酸含量基本維持不變。在乳酸菌接種量為6%時，酒精度和乳酸含量最大，分別為6.8%vol和0.50 g/100 mL。也由此看出乳酸菌的乳酸代謝發酵對酵母菌的酒精發酵過程沒有明顯干擾，對產酒精沒有抑制作用，對酵母菌還有一定的促進作用。因此，選擇乳酸菌接種量為6%為宜。

2.3 發酵溫度對發酵液酒精度和乳酸含量的影響

發酵溫度對發酵液酒精度和乳酸含量的影響結果如圖3所示。

圖3 發酵溫度對酒精度和乳酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and lactic acid content

由圖3可知，發酵溫度對酒精度和乳酸含量的影響明顯。酒精度和乳酸隨著發酵溫度的升高而先增加后下降。當發酵溫度為30 ℃時，酒精度和乳酸均達到最大值，分別為6.8%vol和0.51 g/100 mL；當發酵溫度＞30 ℃時，二者也都呈現下降趨勢，因此，選擇發酵溫度30 ℃為宜。

2.4 發酵時間對發酵液酒精度和乳酸含量的影響

發酵時間對發酵液酒精度和乳酸含量的影響結果如圖4所示。

圖4 發酵時間對酒精度和乳酸含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and lactic acid content

由圖4可知，發酵時間對酒精度和乳酸含量的影響較明顯。酒精發酵前72 h隨著發酵時間的延長，酒精度和乳酸含量均呈逐漸上升的趨勢；發酵時間在72 h，酒精度達到最大值，為6.8%vol，發酵時間＞72 h以后隨著底物耗盡，酒精度開始呈現下降趨勢，乳酸含量趨于平穩。因此，考慮實際生產情況選擇發酵時間72 h為宜。

2.5 發酵工藝條件正交優化結果分析

綜合以上單因素發酵試驗結果，在酒精發酵階段以酒精度和乳酸含量為評價指標，選取酵母菌接種量（A）、乳酸菌接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）為影響因素，設計L9（34）正交試驗優化工藝條件，結果與分析見表3，正交試驗方差分析分別見表4、表5。

表3 發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization

由表3可知，影響發酵液酒精度的因素主次關系是A＞C＞B＞D，有利于酒精生產的最優組合是A2B1C2D2，即酵母菌接種量（A）1.0‰，乳酸菌接種量（B）5%，發酵溫度（C）30 ℃，發酵時間（D）72 h；影響乳酸含量的因素主次關系是B＞D＞A＞C，有利于乳酸生產的最優組合是A2B3C3D2，即酵母菌接種量1.0‰，乳酸菌接種量7%，發酵溫度32 ℃，發酵時間72 h。

表4 以酒精度為評價指標正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index

由表4可知，以酒精度為評價指標因素酵母菌接種量（A）顯著，因素乳酸菌接種量（B）和發酵溫度（C）不顯著，因素作用的主次順序是A＞C＞B，與極差分析得出的結果一致。

表5 以乳酸含量為評價指標正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using lactic acid content as evaluation index

由表5可知，以乳酸為評價指標因素乳酸菌接種量（B）顯著，因素酵母菌接種量（A）和發酵時間（D）不顯著，因素作用的主次順序是B＞D＞A，與極差分析得出的結果一致。

由于兩指標單獨分析出來的最優條件并不一致，因此采取綜合平衡法[14]綜合考慮各因素對指標的影響，從而得到最優條件。綜合分析，酒精發酵階段乳酸菌和酵母菌共酵的最優工藝條件為A2B1C2D2，即酵母菌接種量1.0‰，乳酸菌接種量5%，發酵溫度30 ℃，發酵時間72 h。在此條件下進行驗證試驗，獲得食醋產品的酒精度和乳酸含量分別達到7.8%vol和0.54 g/100 mL。

2.6 食醋質量分析

采用優化的乳酸菌和酵母菌共酵工藝以及單獨使用酵母菌（對照）進行酒精發酵，再進行液態深層醋酸發酵，并陳釀相同時間后得到的2組食醋產品，分別為共酵組和對照組。對2組產品進行感官評價并檢測相關理化衛生指標。

2.6.1 感官評價

共酵組食醋呈現淡黃色、有光澤；有淡淡酯香氣味、酸味柔和醇厚、略帶甜味、無異味；清亮透明、無懸浮物、無沉淀物。2組樣品感官評分結果見圖5。

圖5 液醋感官測評結果對比Fig.5 Comparison of sensory evaluation results of vinegar

由圖5可知，共酵組產品感官評分總分高于對照組樣品，主要體現在其香氣和滋味2個項目上的得分均優于對照組，而在色澤和體態方面2組得分相差不大。

2.6.2 理化指標

理化指標檢測結果如表6所示。

表6 2組食醋樣品理化指標檢測結果對比Table 6 Comparison of physical and chemical indexes results of vinegar

由表6可知，共酵組和對照組在總酸含量相差不大，共酵組產品不揮發酸、總酯和可溶性無鹽固形物含量均明顯高于對照組。特別是不揮發酸含量是對照組的10倍以上，酯類含量是對照組的1.6倍以上，這對改善食醋感官品質很有利[3]。

2.6.3 衛生指標

兩組食醋樣品菌落總數≤50 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌：不得檢出。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用正交優化試驗對酒精發酵工藝條件進行優化，獲得乳酸菌與酵母菌最佳共酵條件為酵母菌接種量1.0‰、乳酸菌接種量5%、發酵溫度30 ℃、發酵時間72 h，在此條件下獲得酒醪的酒精度和乳酸含量分別達到7.8%vol和0.54 g/100 mL。且用該酒醪經液態深層法釀造的食醋呈現淡黃色、清亮透明、有光澤，較純酵母酒精發酵生產的食醋有較濃酯香氣味、酸味更柔和醇厚，質量指標符合國家標準GB 18187—2000《釀造食醋》[15]，改善了液態發酵食醋的品質。

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