超聲輔助提取發酵豆渣蛋白工藝研究

劉 帥，聶乾忠*，方媛媛

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

豆渣是豆腐、豆乳、豆油等大豆制品的副產物，目前，我國每年平均排放豆渣1 500萬t，由于豆渣的水分含量大、水溶性差、口感粗糙，多年來一直沒有得到充分利用，大部分作為飼料使用[1-2]。豆渣中含有豐富的蛋白質、膳食纖維、脂肪、異黃酮以及維生素和礦物質，豆渣蛋白具有較低的過敏性，并且具有人體所需的各種必需氨基酸[3]。國內外研究表明，豆渣具有重要的藥用價值和生理功能，豆渣由于富含膳食纖維、蛋白質、維生素、異黃酮等成分，具有預防腸癌和減肥的功效，以及降低人體的膽固醇含量、降血壓、預防糖尿病及抗氧化等功能[4-7]。因此豆渣具有一定的利用和開發價值，可以作為一種食品資源加以利用。

蛋白的提取方法有很多，如酶法、堿溶酸沉法、反膠束法、鹽析法等[8-9]。近年來利用微生物發酵豆渣生成具有一定生理功能的生物活性肽，以及利用豆渣蛋白粗提物生產功能性食品，成為豆渣開發和利用的主要方向和熱點[10]。豆渣經過微生物發酵后，還原糖、水溶性蛋白、小分子肽、氨基酸的含量得到很大提高，同時在微生物的作用下還產生一些新的功能性成分，具有較大的加工價值[11-13]。另外利用微生物發酵豆渣成本較低，并且減少了化學試劑的使用和殘留，對于倡導綠色食品的今天，采用發酵來生產具有保健功能的豆渣食品具有重要的意義。

本試驗首先采用黑曲霉（Aspergillus niger）對豆渣進行發酵，使部分難溶的豆渣蛋白分解為溶解性較好的多肽，然后采用超聲法和酸溶堿沉法結合的方法，以料液比、堿提溫度、超聲功率、堿液濃度、超聲時間為主要因素，以豆渣蛋白提取率為評價指標，通過單因素和正交試驗，探討豆渣蛋白的最佳提取工藝，為豆渣蛋白的提取與應用提供新的研究思路，以及豆渣的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣：購于湖南農業大學濱湖市場；麩皮：市購；黑曲霉（Aspergillus niger）：湖南農業大學食品科技學院微生物研究室提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、硫酸銅、硼酸、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、硼砂等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；GZ-250-S生化培養箱：韶關市廣智科技設備發展有限公司；FW177型中藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；TD5Z型臺式離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；FD-1B型冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；KDN-04A定氮儀：上海精隆科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

將黑曲霉接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養基上，28 ℃培養72 h，加入一定量的無菌水振蕩洗下成熟的孢子，用無菌紗布過濾，轉移至100 mL三角瓶，在磁力攪拌器上攪拌0.5 h，使孢子分散，制成孢子懸液，用血球計數法控制孢子懸液濃度至106個/mL，作為豆渣發酵的菌懸液[5]。

1.3.2 發酵豆渣蛋白提取的工藝流程及操作要點

新鮮豆渣→前處理→滅菌（121 ℃、20 min）→冷卻→黑曲霉接種→拌勻→發酵（28 ℃、72 h）→滅菌（121 ℃、20 min）→冷卻→干燥（65 ℃、6 h）→粉碎→過篩（100目）→堿法提取/超聲輔助堿法提取→離心（8 000 r/min、20 min）→上清液→酸（HCl）沉（pH 5.4）→離心（8 000 r/min、20 min）→收集沉淀→冷凍干燥（-50 ℃、24 h）→豆渣粗蛋白

操作要點：

前處理：選取新鮮豆渣，除去其中的雜質，并用3層濾布進行壓榨，除去過多的水分。

滅菌：將前處理過的豆渣裝入250 mL錐形瓶中，每瓶20 g，厚度為2～3 cm，121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min。

黑曲霉接種：待豆渣冷卻至室溫后，每瓶接種10 mL黑曲霉孢子懸液，并用已滅菌的玻璃棒攪拌均勻。

發酵：用3層滅菌紗布封住瓶口，將已接種的豆渣置于28 ℃恒溫培養箱中，培養72 h。

干燥：發酵結束后，將發酵產物平攤在淺盤中，65 ℃干燥6 h。

離心：將豆渣蛋白提取液在8 000 r/min的條件下離心20 min。

酸沉：向已離心的上清液中加入0.1 mol/L的HCl溶液，調節至豆渣蛋白等電點pH 5.4，使其沉淀。

冷凍干燥：將收集的豆渣蛋白沉淀在-50 ℃條件下，冷凍干燥24 h，得到豆渣粗蛋白。

1.3.3 發酵豆渣蛋白提取的單因素試驗設計（1）料液比對豆渣蛋白提取率的影響

堿液濃度為0.3 mol/L，提取溫度為50 ℃，超聲提取時間為75 min，超聲功率300 W，料液比分別于1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24、1∶26、1∶28（g∶mL）提取發酵豆渣蛋白，測定蛋白質提取率。

（2）提取時間對豆渣蛋白提取率的影響

料液比1∶24（g∶mL），堿液濃度為0.3 mol/L，溫度50 ℃，超聲功率300 W的條件下提取30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min，測定蛋白質提取率。

（3）提取溫度對豆渣蛋白提取率的影響

料液比為1∶24（g∶mL），堿液濃度為0.3 mol/L，超聲提取時間為75 min，超聲功率300 W，溫度分別于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃提取發酵豆渣蛋白，測定蛋白質提取率。

（4）堿液濃度對豆渣蛋白提取率的影響

料液比1∶24（g∶mL），提取溫度50 ℃，超聲提取時間75 min，超聲功率300 W，堿液濃度分別于0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L提取發酵豆渣蛋白，測定蛋白質提取率。

（5）超聲功率對豆渣蛋白提取率的影響

料液比1∶24（g∶mL），堿液濃度為0.3 mol/L，提取溫度50 ℃，超聲提取時間75 min，超聲功率分別為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W，測定豆渣蛋白的提取率。

1.3.4 發酵豆渣蛋白提取條件的正交試驗優化

以豆渣蛋白提取率為評價指標，通過單一堿溶酸沉法和超聲輔助堿溶酸沉法分別研究料液比、提取溫度、提取時間和堿液濃度對豆渣蛋白質提取率的影響，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗確定豆渣蛋白最佳提取工藝，正交試驗因素與水平見表1。

表1 提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5 測定指標

蛋白質含量測定采用國標GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。蛋白質提取率計算公式如下：

式中：M為提取蛋白質含量，g；N為豆渣中蛋白質含量，g。

2 結果與分析

2.1 料液比對豆渣蛋白提取率的影響

由圖1可知，兩種方法的提取率都是隨著料液比的增大，先增加后趨于不變。超聲輔助堿溶酸沉法的提取率明顯高于單一堿溶酸沉法。單一堿溶酸沉法在料液比達到1∶24（g∶mL）時，提取率達到64.75%，然后變化幅度變小，超聲輔助堿溶酸沉法在料液比1∶22（g∶mL）時，提取率達到79.18%，隨后趨于不變。最初料液比增加，提取率增加，可能是由于隨著料液比增加，體系的黏度降低，蛋白質的擴散速率加快，有利于蛋白質溶解在堿液中，當料液比增加到一定的程度后，提取率逐漸趨于穩定，這是因為隨著加水量的增多，使得蛋白質濃度過低[14]。因此選擇料液比為1∶22、1∶24、1∶26（g∶mL）進行正交試驗。

圖1 料液比對豆渣蛋白提取的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on okara protein extraction rate

2.2 提取時間對豆渣蛋白提取率的影響

由圖2可知，兩種方法的提取率都是隨著提取時間的增長先上升后達到一個平衡值，不再上升，可能是因為豆渣在提取過程中需要一定的時間進行溶脹，并且超聲使得蛋白的溶出和擴散速度不斷增加，使得提取時間大大縮短。單一堿溶酸沉法在提取時間為120 min時，提取率達到64.25%，同時超聲輔助堿溶酸沉法時間為120 min時，提取率達到77.5%，提取率比單一堿溶酸沉法有較大提高，而超聲輔助堿溶酸沉法提取率在60～120 min，變化不大，因此選擇提取時間60 min、75 min、90 min進行正交試驗。

圖2 提取時間對豆渣蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on okara protein extraction rate

2.3 提取溫度對豆渣蛋白提取率的影響

由圖3可知，兩種提取方法的提取率都是隨著提取溫度的上升先增加后降低，單一堿溶酸沉法在溫度為50 ℃時，提取率達到最大值69.15%，超聲輔助堿溶酸沉法在溫度為55 ℃時達到最大提取率為77.23%。隨著提取溫度的升高，蛋白質的提取率增加，可能是因為溫度上升，分子的熱運動加劇，蛋白質的溶解和擴散程度增加，從而提高了提取率，但是溫度過高，提取率下降是因為溫度過高使豆渣蛋白分子變性，溶解度降低[9]。因此選擇提取溫度為45 ℃、50 ℃、55 ℃進行正交試驗。

圖3 提取溫度對豆渣蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on okara protein extraction rate

2.4 堿液濃度對豆渣蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著氫氧化鈉濃度的升高，豆渣蛋白的提取率不斷增加，在增加到一定程度后，趨于穩定，甚至略有下降。單一堿溶酸沉法在氫氧化鈉達到0.3 mol/L時，提取率達到61.35%，然后增大的幅度逐漸減小，超聲輔助堿溶酸沉法在氫氧化鈉濃度達到0.3 mol/L時，提取率達到最大值78.46%，然后逐漸下降。研究表明，在堿液濃度過高時，蛋白質會發生變性，使得蛋白的溶解度下降，并在后期的酸沉淀中生成大量的鹽，不利于蛋白質的除鹽純化[15]。綜合考慮，選擇氫氧化鈉濃度為0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L進行正交試驗。

圖4 堿液濃度對豆渣蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on okara protein extraction rate

2.5 超聲功率對豆渣蛋白提取率的影響

由圖5可知，豆渣蛋白提取率隨著超聲功率的增加，提取率先上升，后逐漸趨于平緩，這可能是由于隨著超聲功率的增加，可產生強烈的空化、湍動和熱效應使得空化泡崩潰的時間變短，從而提高了蛋白質的溶解速率，當聲強達到一定的強度后，會使得蛋白質變性，從而不利于蛋白質提取[16]。已發酵豆渣蛋白提取率明顯高于未發酵豆渣，可能是因為在發酵過程中，蛋白酶的作用使得部分大分子蛋白質酶解為可溶性小分子多肽，從而增加了蛋白的溶解性。綜合考慮，超聲功率為300 W。

圖5 超聲功率對豆渣蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on okara protein extraction rate

2.6 提取條件優化正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗確定豆渣蛋白最佳提取工藝，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2極差分析結果可知，影響豆渣蛋白提取率的各因素依次是：提取溫度＞提取時間＞堿液濃度＞料液比，最佳提取工藝為A3B3C2D2，即提取溫度為55 ℃，提取時間為90 min，堿液濃度為0.3 mol/L，料液比為1∶24（g∶mL）。在此最佳條件下進行3次驗證試驗，豆渣蛋白平均提取率為83.84%。由表3方差分析結果可知，超聲時間和提取溫度對發酵豆渣蛋白的提取率有顯著影響（P＜0.05），料液比和堿液濃度對發酵豆渣蛋白的提取率影響均不顯著。

3 結論

由單因素試驗結果可知，超聲輔助堿溶酸沉法比單一堿溶酸沉法在同樣條件下蛋白提取時間縮短，提取率升高，已發酵豆渣比未發酵豆渣蛋白提取效果好，同樣條件下提取率大幅提高。

由正交試驗結果可知，影響豆渣蛋白提取率的各因素依次是：提取溫度＞提取時間＞堿液濃度＞料液比，超聲輔助堿溶酸沉法提取發酵豆渣條件是：提取溫度為55 ℃，提取時間為90 min，堿液濃度為0.3 mol/L，超聲功率為300 W，料液比為1∶24（g∶mL）。在此最佳條件下，發酵豆渣蛋白的提取率是83.84%，對于豆渣蛋白的提取與應用具有一定的參考意義。

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