血清N-乙酰天門冬氨酸與早期神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的相關(guān)性研究*

沈小平 王士列 劉建平 李年春 鄭團(tuán)圓 劉煜帆

神經(jīng)變性病（Neurodegenerative Diseases）是指由于神經(jīng)元變性、凋亡所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是一組原因不明的中樞系統(tǒng)疾病，他們可能具有相類似的發(fā)病機(jī)制[1-2]。隨著老齡化日趨嚴(yán)重，神經(jīng)變性疾病的發(fā)病率逐漸升高。2007年我國60歲以上人口已達(dá)1.49億，其中80歲以上者有1600萬。預(yù)計(jì)2040年60歲以上的人口將達(dá)到3.97億，80歲以上的老人將達(dá)到1億。阿爾茨海默病（AD）和帕金森病（PD）是老年人中發(fā)病率居于前2位的神經(jīng)變性疾病，65歲以上AD的患病率為5%，70歲以上為10%，80歲以上則高達(dá)30%；65歲以上PD的患病率為1%，隨年齡增加而升高。AD和PD已成為嚴(yán)重危害老年人身心健康、增加家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)的神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病。目前這類疾病的早期診斷仍十分困難，可能的手段包括功能影像學(xué)、分子遺傳學(xué)檢查等，這些檢查設(shè)備、技術(shù)要求高，難以作為疾病早期篩查手段應(yīng)用于臨床。N-乙酰天門冬氨酸（N-acetyl aspartic acid，N-AA）是神經(jīng)系統(tǒng)的特定代謝產(chǎn)物，通常被作為腦內(nèi)神經(jīng)元變化的一個(gè)標(biāo)志物。本研究以AD、PD患者及正常老年人作為研究對象，通過檢測其血清NAA含量，并聯(lián)合顱腦磁共振波譜（MRS）測定其腦內(nèi)NAA含量，研究患者血清NAA及腦內(nèi)NAA的變化是否具有一致性。進(jìn)一步探討血清NAA與早期神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的相關(guān)性；建立一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的篩查手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2014年1月-2015年1月住院及門診的AD患者30例，符合2011年美國NIA/AA阿爾茨海默病診斷標(biāo)準(zhǔn)中很可能AD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；PD患者30例，符合2006年《中華神經(jīng)科雜志》發(fā)表的中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙及帕金森病學(xué)組制定的帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇同時(shí)期門診體檢的健康老年人30例。所有入選者均排除有腦白質(zhì)疏松、腦卒中、腦外傷、腦炎、腫瘤、多發(fā)性硬化、偏頭痛、癲癇等各種腦損傷者。三組年齡、性別及受教育年限比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

表1 三組年齡、性別及受教育年限比較

1.2 方法

1.2.1 血清NAA的測定 取早晨空腹靜脈血5 mL，室溫凝固后收集血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ錘AA測定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。方法如下：（1）以NAA標(biāo)準(zhǔn)品建立保準(zhǔn)曲線。（2）確定氣相色譜質(zhì)譜條件。（3）精密度試驗(yàn)：用變異系數(shù)（CV）表示精確性。在上述色譜條件下，取低、中、高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品的血清樣本進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度實(shí)驗(yàn)。（4）回收試驗(yàn)：取正常空白血清樣品100 μL，分別加入10、100和1000 μg/mL NAA標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL，配成低、中、高三種濃度的溶液，采用上述色譜條件進(jìn)行上機(jī)分析。（5）定量下限：當(dāng)信噪比S/N=10時(shí)，測得該方法檢測NAA的定量下限。

1.2.2 腦內(nèi)NAA檢測 采用1H-MRS檢查。通過常規(guī)MRI掃描，應(yīng)用點(diǎn)解析頻譜序列（point resolved spectroscopy，PRESS）來獲得三維波譜化學(xué)位移成像圖（3D-CSI），感興趣區(qū)（ROI）為雙內(nèi)側(cè)顳葉及海馬區(qū)。自動(dòng)預(yù)掃描程序完成發(fā)射或接受增益調(diào)節(jié)、體素內(nèi)勻場、水抑制和無水抑制掃描。磁共振掃描儀自帶軟件自動(dòng)完成基線校準(zhǔn)、信號(hào)平均，識(shí)別并計(jì)算各代謝物波峰曲線下面積。不同化合物中原子核的化學(xué)位移不同，根據(jù)磁共振波譜中其共振峰（化學(xué)位移）的位置不同可加以鑒別。化學(xué)位移的大小以磁共振頻率的百萬分之一（ppm）表示，MR波譜中以橫坐標(biāo)來表示，縱坐標(biāo)代表代謝產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度單位。與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的主要代謝物的化學(xué)頻移位置為：N-乙酰天門冬氨酸（NAA）2.01 ppm、肌酸（Cr）3.03 ppm、肌醇（mI）3.56 ppm。并能自動(dòng)給出以Cr為參照的各種代謝物信號(hào)強(qiáng)度的比值（NAA/Cr、NAA/mI）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x-±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，三組比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組雙內(nèi)側(cè)顳葉代謝物濃度的比較 雙內(nèi)側(cè)顳葉NAA的含量為NC組>PD組>AD組，而血清NAA含量剛好相反，代謝物比值NAA/Cr、NAA/mI及血清NAA三組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中AD組與PD組兩組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2 三組雙側(cè)海馬區(qū)代謝物濃度的比較 三組雙側(cè)海馬區(qū)NAA的含量為NC組>PD組>AD組，而血清NAA含量AD組>PD組>NC組（P<0.05），AD組與PD組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表2 三組雙內(nèi)側(cè)顳葉NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

表2 三組雙內(nèi)側(cè)顳葉NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

*與NC組比較，P<0.05

組別 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 組（n=30）2.01±1.01 1.59±0.40 7.80±2.01 6.76±2.12 0.085±0.013 AD 組（n=30）1.28±0.90* 1.68±1.35* 3.91±2.13* 3.78±2.14* 0.102±0.016*PD 組（n=30）1.30±0.80* 1.71±0.92* 4.14±2.12* 3.49±2.08* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表3 三組雙側(cè)海馬區(qū)NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

表3 三組雙側(cè)海馬區(qū)NAA濃度與血清NAA的比較（±s）

*與NC組比較，P<0.05

組別 NAA/Cr（L）NAA/Cr（R）NAA/mI（L）NAA/mI（R）血清NAA NC 組（n=30）1.50±0.40 1.74±0.46 2.80±0.76 2.82±1.08 0.085±0.013 AD 組（n=30）1.06±0.28* 1.23±0.34* 1.16±0.48* 1.48±0.80* 0.102±0.016*PD 組（n=30）1.26±0.30* 1.34±0.42* 1.86±0.82* 1.74±0.78* 0.980±0.012*P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

3 討論

3.1 磁共振波譜分析腦內(nèi)NAA的濃度變化 近來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)變性病具有共同特征，各種類型除了受損部位不同之外，組織病理學(xué)均顯示神經(jīng)細(xì)胞染色變淡、萎縮、胞體表面不平、細(xì)胞核固縮或碎裂、胞漿內(nèi)虎斑溶解、細(xì)胞突減少、突觸水腫或萎縮。神經(jīng)變性病大多在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)有包涵體存在，例如，PD和額顳型癡呆的Lewy小體、AD的平野Hirano小體、Pick病時(shí)的Pick小體及肌萎縮側(cè)索硬化的Bunina小體等包涵體。這些小體形態(tài)大致相似，這些小體也都是細(xì)胞內(nèi)各種不同類型蛋白質(zhì)的異常聚集所致，包括突觸核蛋白、磷酸化tau蛋白、淀粉樣蛋白及泛素化蛋白等。目前已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)變性病的發(fā)病大多有以下共同因素有關(guān)：遺傳基因突變線粒體能量代謝缺陷，活性自由基分子生成過多，興奮性氨基酸釋放過度，鈣離子通道開放和鈣離子內(nèi)流，以及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾異常和神經(jīng)營養(yǎng)因子供應(yīng)不足等[3]。本課題研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)雙內(nèi)側(cè)顳葉及海馬區(qū)AD組和PD組NAA/Cr、NAA/mI均明顯低于NC組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與AD患者的磁共振波譜變化具有一致性；AD患者出現(xiàn)這種特征性的波譜改變的原因可能有：AD患者腦內(nèi)老年斑形成與神經(jīng)原纖維纏結(jié)引起NAA的缺乏，同時(shí)伴有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生導(dǎo)致mI的過剩；AD患者內(nèi)側(cè)顳葉及海馬等結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)神經(jīng)元的廣泛脫失，引起NAA降低，同時(shí)伴有膽堿能、腎上腺能和5-羥色胺能遞質(zhì)系統(tǒng)障礙，毒蕈堿樣膽堿能受體和α-腎上腺能受體激活時(shí)多伴有磷酸肌醇的水解，為了維持受體的功能必須加速肌醇等物質(zhì)再合成磷脂酰肌醇的過程，因而患者腦內(nèi)mI水平較高，1H-MRS測量NAA值降低[4-8]。既往學(xué)者Schuff等[9]研究發(fā)現(xiàn)：利用1H-MRS和MRI研究36~85歲年齡段的24例健康成年人的海馬代謝物及其體積的變化，發(fā)現(xiàn)NAA/肌酸（Cr）的比例下降了26%，海馬體積縮小了20%。這表明NAA的水平在正常老年人也有所下降。因此，MRS可通過測定腦組織內(nèi)多種微量代謝物的含量來分析局部組織代謝的改變，尤其適用于神經(jīng)系統(tǒng)生化及代謝變化的研究。

3.2 血清NAA與腦內(nèi)NAA的關(guān)系 NAA是神經(jīng)系統(tǒng)的特定代謝產(chǎn)物，由天門冬氨酸和乙酰輔酶A在神經(jīng)元線粒體中合成的[10]，是人腦中最集中的神經(jīng)肽，正常情況下，NAA的清除是從神經(jīng)元到少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，當(dāng)發(fā)生病理改變的時(shí)候，損傷的神經(jīng)元中NAA的釋放會(huì)增加，此時(shí)NAA首先進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞并進(jìn)入血液循環(huán)[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)NC組血清NAA較AD組和PD組患者的血清NAA明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)血清NAA與腦內(nèi)NAA呈負(fù)相關(guān)。Simone等[14]研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）患者血清NAA的水平明顯高于正常對照者，高水平的NAA與ALS的臨床表現(xiàn)密切相關(guān)；也有學(xué)者在多發(fā)性硬化（MS）患者中，腦NAA的MRS顯示NAA降低，而血清NAA濃度升高[15]，而健康人群中，血清NAA濃度與年齡、性別無顯著相關(guān)性[16]。提示腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞損害后NAA可能釋放到體液中，所以血清NAA濃度升高可能反映出腦內(nèi)NAA下降。血清中NAA的測定有可能作為神經(jīng)變性病患者的一種排除性診斷手段。

對于臨床前期AD、PD患者，他們都是癡呆的高危人群，對這些人群進(jìn)行早期診斷和干預(yù)，有效地遏制或延緩疾病的進(jìn)展，對社會(huì)及患者家庭都具有重大意義。目前，AD等神經(jīng)變性病早期診斷的研究主要聚焦于顱腦影像學(xué)及體液生物學(xué)標(biāo)記，其中血液生物學(xué)標(biāo)記物如血漿B淀粉樣蛋白及其相關(guān)抗體、胞外B淀粉樣蛋白分子伴侶等有望用于AD的早期診斷。血液生物標(biāo)記因樣本獲取簡便，與疾病的病理過程聯(lián)系緊密，診斷敏感性及特異性較高，可能成為今后神經(jīng)變性病的早期生物學(xué)標(biāo)記研究的熱點(diǎn)。

[1]林善華.中醫(yī)藥治療帕金森病研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（13）：154-156.

[2]張海燕，劉忠錦，馮化杰，等.天王補(bǔ)心丹對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及PKC、Aβ的影響[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（21）：12-13.

[3] Jellinger K A.Recent advances in our understanding of neurodegeneration[J].J Neural Trans，2009，116（14）：1111-1162.

[4] Lazeyras F， Charles H C， Tupler L A， et al. Metabolic brain mapping in Alzheimer’s disease using proton magnetic resonance spectroscopy[J]. Psychiatry Res， 1998，82（2）：95-106.

[5] Jessen F， Block W， Traber F， et al.Proton MR Spectroscopy detects a relative decrease of N-acetyl aspartate in the medial temporal lobe of patients with AD[J]. Neurology， 2000，55（5）：684-688.

[6] Block W， Traber F， Flacke S，et al.In vivo proton MR-spectroscopy of the human brain： Assessment of N-acetyl aspartate（NAA）reduction as a marker for neurodegeneration[J].Amino Acids，2002，23（13）：317-323.

[7] Harada M， Miyoshi H， Otsuka H， et al. Multivariate analysis of regional metabolic differences in normal aging on localized quantitative proton MR spectroscopy[J].Neuroradiology，2001，43（6）：448-452.

[8] Huang W，Alexander G E，Chang L，et al.Brain metabolite concentration and dementia severity in Alzhemier’s disease： a 1H MRS study[J].Neurology，2001，57（4）：626-632.

[9] Schuff N，Meyerhoff D J，Mueller S，et al.N-aeetylaspartate as a marker of neuronal injury in neurodegenerative disease[J].Adv Exp Med Biol，2006，576（145）：241-363.

[10] Moffety J R，Ross B，Arun P，et a1.N-Acetylaspartate inthe CNS：from neurodiagnostics to neurobiology[J].Prog Neurobiol，2007，81（2）：89-101.

[11] Sager T N，Thomsen C，Valsborg J S，et a1.Astrogliacontain a specific transport mechanism for N-aeetylaspartate[J].J Neurochem，1999，73（2）：807-811.

[12] Chak R，Aborty G，Mekala P，et al.Intraneuronal N-acetylaspartate supplies acetyl groups for myelin lipid synthesis：evidence for myelin-associated aspartoacylase[J]. Neurochem，2001，78（4）：736-745.

[13] Sager T N，Thomsen C，Valsborg J S，et al.Astroglia contain a specific transport mechanism for N-acetylaspartate[J].Neurochem，1999，73（2）：807-811.

[14] Simone I L，Ruggieri M，Tortelli R，et al.Serum N-acetylaspartate level in amyotrophic lateral sclerosis[J].Arch Neurol，2011，68（10）：1308-1312.

[15] Tortorella C， Ruggieri M， Di Monte E， et al. Serum and CSF N-acetyl aspartate levels differ in multiple sclerosis and neuromyelitis optica[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry，2011，82（65）：1355-1359.

[16] Ruggieri M，Tortorella C，Ceci E，et al.Age-related changes of serum N-acetyl-aspartate in healthy controls[J]. Age Ageing，2011，40（14）：391-395.