蒙藥扎沖十三味丸對大鼠缺血性腦損傷后海馬組織細胞凋亡影響的初步研究*

劉鑫 陶春 林琳

扎沖十三味丸出自《蒙醫經典》[1]，又名嘎日迪十三，在蒙醫臨床中是最常用的首選傳統方劑之一，主要用于心腦血管和神經系統疾病的治療[2]，經臨床證實，對于腦血栓、腦梗死、腦萎縮、腦中風偏癱、言語不清等腦血管病、心肌缺血等疾病有明確療效[3-6]。扎沖十三味丸目前雖然在臨床治療方面已經顯示出較為確切的療效，近年來很多學者致力于從作用機理、作用靶點等方面為此藥提供理論依據，實驗結果證實扎沖十三味丸可以保護血腦屏障，可以減輕氧自由基對細胞的損害[7]，減輕缺血后腦組織水腫[8]。明確此藥的作用機理，對于扎沖十三味丸的進一步開發和應用具有重要意義。

細胞凋亡與腦缺血再灌注后的損傷關系密切，且在腦梗死的發生、發展過程中發揮重要作用[8-9]。腦缺血及再灌注損傷后及時進行抗凋亡治療具有重要意義。本研究擬通過誘發小鼠腦梗死缺血缺氧引起神經細胞損傷后，從凋亡的角度研究扎沖十三味丸對腦缺血性損傷的保護性，研究其作用機理，從細胞和分子水平上闡明蒙成藥扎沖十三味丸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 扎沖十三味丸，PBS，annexin-V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（購自上海貝博生物試劑公司），BD Calibur流式細胞儀，BD公司產品；bax/bcl-2 Elisa試劑盒（購自天津海晶精細化工廠），酶標儀，MK3型，芬蘭雷勃公司。

1.2 動物與分組 清潔級SD大鼠，雌雄均可，共72只，重量180~210 g，購自吉林大學實驗動物中心（許可證號吉2007-0003），動物分籠飼養（環境溫度24~26 ℃，濕度60%~70%），自由飲水，術前12 h禁食。將大鼠隨機分為三組：正常對照組、模型組、給藥組。模型組和給藥組根據術后處死時間不同，又分作1、3、5、7 d組。每組各8只大鼠。

1.3 模型制備 制作SAH模型，采用大鼠自體顱內血經枕大池二次注射。配制10%水合氯醛（0.35/100 g）于腹腔注射麻醉后，在操作臺上將大鼠俯臥位固定，安爾碘常規消毒，項部備皮。取左右耳根部連線的中點，沿正中線縱向切開頸部皮膚，將枕骨、環椎及環枕膜暴露于視野下，用1 mL注射器針頭將環枕膜刺破后再微微推進至枕大池，待有腦脊液流出后，自大鼠左眼球后靜脈叢抽取0.3 mL自體血，無需抗凝，隨后按照0.15 mL/100 g（體重）標準，將自體非抗凝血以0.1 mL/min的注射速度緩慢注入大鼠枕大池。用明膠海綿壓迫穿刺點3 min，縫合切口。將大鼠俯臥位30 min，并保持頭低30°體位，以利于血液凝固并沉積在腦底血管周圍。待大鼠保溫復蘇至清醒后，可自由飲食飲水。48 h后同樣操作方法制作大鼠腦梗死模型。嘎日迪-13味丸組在手術第2天開始給嘎日迪-13味丸灌胃。在第2次注射后第1、3、5、7天取腦待檢。

1.4 模型成功標志 待大鼠自然蘇醒后，根據Longa 5分制評分標準，對大鼠神經功能缺失進行評分。無明顯損傷癥狀者為0分；對側前爪不能完全伸展者為1分；行走時肢體向對側旋轉者為2分；行走時向對側傾倒者為3分；意識喪失，不能自發行走者為4分。評分結果在1~3分內的鼠為有效模型。剔除未入選及死亡的大鼠，每組剩余6只。

1.5 給藥方法 按照2%的濃度，將扎沖十三味丸用蒸餾水配制成溶液，灌胃給藥，每日1次，模型組大鼠均喂予蒸餾水。正常對照組大鼠置同一環境下飼養。

1.6 標本取材 待第2次注血后，在第1、3、5、7天分別采用斷頭法處死各組大鼠，迅速取出腦海馬組織。全部取材過程置于冰盒上進行。

1.7 凋亡細胞的檢測 將取出的海馬組織置于金屬細胞篩上，用玻璃注射器芯研磨，并用顯微鏡下觀察，待研磨成單細胞后，加入PBS離心10 min，棄上清后取沉淀用PBS稀釋至10 mL，反復吹打制成單細胞懸液，經400目細胞篩過濾，調整細胞濃度至1×106/mL，按照試劑盒操作步驟，取1 mL細胞懸液，依次標記annexin-V-FITC和PI，上機檢測，檢測結果進行統計學處理。

1.8 Bcl-2、Bax蛋白的表達檢測 取海馬組織研磨后離心的上清液，加50 μL于反應孔內，然后立即加入50 μL的生物素標記的抗體，37 ℃溫育1 h，洗滌后每孔加入60 μL的親和鏈酶素-HRP，37 ℃溫育30 min，洗滌后每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃溫育10 min。加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的OD值。計算Bcl-2、Bax蛋白的濃度。

1.9 統計學處理 使用SPSS 17.0統計分析軟件，計量資料以（x-±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組凋亡細胞檢測結果比較 模型組各時間點中細胞凋亡率均高于正常對照組（P<0.05），造模成功；給藥組中，各時間點與相應時間點模型組比較，凋亡率顯著降低，與正常對照組相比較亦有明顯降低（P<0.05）。見表1。

2.2 各組Bax、Bcl-2蛋白的表達檢測比較 模型組Bax蛋白表達水平均高于正常對照組的（40.53±3.39）pg/mL；給藥組與模型組相比較，Bax蛋白表達減少，其中1 d和5 d組有顯著差異（P<0.05）。模型組Bcl-2蛋白表達水平均低于正常對照組的（24.71±1.44）pg/mL；給藥組與模型組相比較，各時間點Bcl-2蛋白表達均增高（P<0.05）。見表2。

表1 蒙藥扎沖十三味丸對海馬組織流式細胞儀的檢測數據（±s） %

表1 蒙藥扎沖十三味丸對海馬組織流式細胞儀的檢測數據（±s） %

組別 7 d 5 d 3 d 1 d給藥組（n=6）0.43±0.19 0.30±0.35 0.20±0.02 0.13±0.09模型組（n=6）7.05±2.60 2.08±0.80 3.94±2.47 1.50±0.35正常對照組（n=6）1.13±0.14 1.13±0.14 1.13±0.14 1.13±0.14

表2 蒙藥扎沖十三味丸對缺血缺氧腦海馬組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響（±s） pg/mL

表2 蒙藥扎沖十三味丸對缺血缺氧腦海馬組織Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影響（±s） pg/mL

*與模型組比較，P<0.05

Bcl-2蛋白組別 Bax蛋白1 d 3 d 5 d 7 d 1 d 3 d 5 d 7 d模型組（n=6） 74.05±14.15 57.78±04.24 65.53±10.46 66.40±9.40 18.56±4.62 16.23±2.66 17.85±1.70 16.17±1.74給藥組（n=6） 49.42±7.64* 42.42±1.80 42.54±2.03* 40.98±1.88 63.37±26.98*90.30±21.14*70.83±27.05* 126.10±26.48*

3 討論

缺血性腦損傷中細胞死亡機制包括細胞壞死和細胞凋亡，壞死發生迅速且不可逆，目前沒有辦法可以干擾這一過程。而在梗死灶周邊的缺血半暗帶區內，細胞壞死和凋亡共存，如不能進行及時有效的治療，會向著不可逆性損傷發展，細胞啟動凋亡程序存在一段時間延擱，抓住這段機間進行有效治療可以在一定程度上逆轉缺血后的腦損傷。

本實驗通過流式細胞術檢測凋亡細胞數量變化來探討扎沖十三味丸在缺血發生后對神經細胞的保護作用。流式細胞檢測結果顯示，正常對照組仍有少量凋亡細胞，可能是腦組織細胞生長發育過程中發生的生理性凋亡以及手術刺激引起的凋亡；模型組各時間點凋亡細胞均較正常對照組顯著增多，證實腦缺血引發細胞損傷過程中，細胞凋亡確實是一種重要損傷形式；扎沖十三味丸給藥組所有時間點細胞凋亡率均顯著少于與模型組，顯示扎沖十三味丸可以明顯降低腦缺血損傷后神經細胞凋亡的程度 ，通過抗凋亡的機制對腦神經細胞起到保護作用。本課題組其他實驗已經證實[10]扎沖十三味丸能夠減小腦組織梗死范圍，給藥組腦梗死范圍比實驗組有明顯減小，說明扎沖十三味丸可以通過緩解神經細胞凋亡，達到逆轉缺血性損傷的目的，起到對腦缺血損傷神經的保護作用。

目前認為細胞凋亡主要有兩條途徑，凋亡受體途徑及線粒體途徑[11]。胞外刺激和胞內刺激往往啟動線粒體途徑[12]。Bax蛋白和Bcl-2蛋白主要分布在線粒體外膜、內質網及胞質面上，Bax蛋白能在線粒體膜上形成孔道，使細胞色素C等小分子物質進入胞質從而促進凋亡的發生，Bcl-2蛋白能通過封閉孔道，調控線粒體膜電位等方式抑制凋亡[13]。而本實驗選擇Bcl-2蛋白家族成員中Bax蛋白和Bcl-2蛋白進行研究，Elisa檢測結果顯示，模型組大鼠腦梗死灶中，對于促進凋亡的Bax蛋白，蛋白表達水平均高于正常對照組，提示缺血大鼠腦組織的損傷中有Bax促凋亡機制的參與，而給藥組與模型組相比較，Bax蛋白表達量減少。說明通過藥物治療后，促凋亡蛋白表達下降。在檢測抑制凋亡的Bcl-2蛋白時顯示，模型組蛋白表達水平均低于正常對照組，給藥組蛋白表達量均顯著高于模型組，以上結果提示扎沖十三味丸可以增加bcl-2蛋白表達量，同時下調bax蛋白表達，促進Bcl-2同源二聚體形成，通過線粒體凋亡途徑從而發揮抗凋亡作用。

從上述結果可以看出，輔以扎沖十三味丸能夠更大限度的緩解神經細胞凋亡的發生，從而起到保護腦細胞及神經功能的作用。這一結果符合目前廣泛采用的急性腦梗死治療的搶救原則，即降低病灶半暗區中受損腦細胞的凋亡程度[14]。同時，減少細胞凋亡發生，能夠緩解腦缺血恢復血液再灌注后的損傷[15-19]。綜上所述，扎沖十三味丸可以通過減少神經細胞凋亡，阻止梗死范圍擴大，達到逆轉缺血性損傷的目的，同時減輕恢復血液再灌注后的進一步損傷。在腦缺血發生后，應用扎沖十三味丸能夠對缺血性腦損傷海馬組織中的神經細胞起到很好的保護作用。

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