基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠急性心肌梗死的療效觀察*

熊永泉 陸東風 何志裕

隨著我國科技及醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，細胞性心肌成形術(shù)不斷發(fā)展，已經(jīng)成為冠心病和心力衰竭治療、研究的熱點，為終末期心臟病患者的治療帶來了新的希望。為進一步研究骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性心肌梗死細胞的治療作用，本研究以大鼠模型為觀察對象進行研究，旨在為臨床應用骨髓間充質(zhì)干細胞移植提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選取15 d齡SD乳鼠20只，體質(zhì)量（210±45） g。

1.2 試劑和儀器 血管內(nèi)皮生長因子165、磷酸鹽、0.2 g/L乙二胺四乙酸、0.5 g/L胰蛋白酶、甲醛（體積分數(shù)10%）、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、jet-PEI 細胞轉(zhuǎn)染試劑盒、CM-DiI（Cell TrackerTM C-7001）、DMEM低糖培養(yǎng)基（含10 000u肝素）、HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探頭、ElivisionTM plus兩步試劑盒

1.3 方法

1.3.1 急性心肌梗死動物模型的制備 本研究模型制備的方法為：首先麻醉大鼠，本研究選用的麻醉方式為腹腔注射麻醉，麻醉藥選用1%的戊巴比妥鈉40~50 mg/kg。麻醉成功后，需氣管插管，并連接呼吸機輔助呼吸。前期工作完成后，進入模型制備階段，助手常規(guī)消毒鋪單后，由本研究統(tǒng)一研究人員進行手術(shù)操作，具體操作步驟如下：首先，于大鼠距胸骨左側(cè)約0.5 cm處沿3、4肋間作縱形切口，逐層剝離后進入胸腔，將心臟充分暴露于手術(shù)視野，然后于左心耳下緣與肺動脈圓錐之間距主動脈根部2.0~3.0 mm處，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，結(jié)扎完成后，觀察結(jié)扎區(qū)域是否變白，局部心肌是否運動減弱，以確定是否結(jié)扎成功，本研究選用的判定標準為兩個以上肢體導聯(lián)或胸導出現(xiàn)ST段抬高0.2 mV以上。

1.3.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的提取、培養(yǎng) 將大鼠處死后，于無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，剔除肌肉、骨膜，剪一側(cè)骨端。本研究選用10 mL無血清DMEM低糖培養(yǎng)基（含10 000u肝素）將大鼠股骨和脛骨內(nèi)的骨髓細胞沖出，將沖出的液體收集后制成單細胞懸液，濾去骨渣及碎肉組織，將剩余液體放置于離心管中，并以1500 r/min的速度，于20 ℃的環(huán)境下進行離心，離心時間為5 min，完成后棄上清液，加入含體積分數(shù)為0.1胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中重懸，然后將細胞懸液注入預先加有密度為1.073的細胞分離液的試管中，并以2000 r/min的速度，于20 ℃的環(huán)境下進行離心，離心時間為30 min。離心結(jié)束后，取中間的細胞層，再用磷酸鹽緩沖液清洗2次后進行原代培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，觀察到骨髓間充質(zhì)干細胞80%貼滿培養(yǎng)瓶底時進行傳代消化，本研究采用的方法為：0.2 g/L的乙二胺四乙酸和0.5 g/L的胰蛋白酶按1∶1比例混合進行，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。1.3.3 血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞方法 本研究采用pcDNA3.1（-）/h血管內(nèi)皮生長因子165對骨髓間充質(zhì)干細胞進行轉(zhuǎn)染。按上述步驟消化、離心骨髓間充質(zhì)干細胞后，按105接種于6孔培養(yǎng)板，按jet-PEI試劑盒說明書操作步驟對其進行轉(zhuǎn)染。

1.3.4 骨髓間充質(zhì)干細胞的標記方法 本研究選用CM-DiI溶液進行標記，運用0.01 mmol/L D-PBS將質(zhì)量濃度為2 g/L的CM-DiI溶液稀釋至2 μmol/L，取生長良好的三、四代細胞，用0.01 mmol/L D-PBS洗滌3次，于37 ℃的環(huán)境下加入濃度為2 μmol/L 的CM-DiI，在4 ℃的環(huán)境下于體積分數(shù)5% CO2的孵箱內(nèi)孵育15 min。

1.3.5 細胞移植方法 將本研究大鼠分為兩組，分別為觀察組（血管內(nèi)皮生長因子組）和對照組（DMEM組），每組10只大鼠。將用CM-DiI標記的骨髓間充質(zhì)干細胞進行消化離心，按5×106重懸浮，觀察組大鼠在缺血區(qū)邊緣分4點注射細胞懸液40 μL，對照組大鼠注射無血清DMEM 40 μL，注射部位和方式均與觀察組大鼠相同，注射完成后逐層關胸，待大鼠自主呼吸完全恢復后脫機拔管。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠的大體心臟功能 于細胞成功移植后1個月，麻醉大鼠，采用的麻醉方式為腹腔麻醉，麻醉藥采用巴比妥鈉麻醉，劑量為30 mg/kg，將大鼠仰臥位固定于解剖臺，運用HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探頭檢查。計算大鼠左室收縮末期容積和舒張末期容積，并計算出左室射血分數(shù)=（左室舒張末期容積-左室收縮末期容積）/左室舒張末期容積。

1.4.2 蘇木精-伊紅染色 移植后1個月，麻醉大鼠，尾靜脈注入高鉀液及肝素，迅速取出心臟，PBS漂洗、固定、石蠟包埋、切片、脫水后行蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.4.3 新生血管密度 對心臟標本病理切片，行Ⅷ因子染色，每只大鼠取5張切片，分別在每個切片梗死區(qū)周邊隨機選擇5個視野，計數(shù)毛細血管數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，計量資料用（x-±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠左心室功能比較 觀察組與對照組大鼠LVEF分別為（73.45±9.17）%、（43.26±6.33）%，觀察組明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 兩組大鼠蘇木精-伊紅染色結(jié)果比較 兩組大鼠鏡下均見左室瘢痕組織形成，有新生血管生成，并出現(xiàn)左室重塑特征，觀察組大鼠心臟改變較對照組明顯，見圖1~2。

圖1 觀察組大鼠鏡下結(jié)果

圖2 對照組大鼠鏡下結(jié)果

2.3 兩組大鼠血管再生情況比較 觀察組大鼠與對照組大鼠血管密度分別為（45.69±4.28）、（17.41±3.67），觀察組明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

隨著我國科技及醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，細胞性心肌成形術(shù)不斷發(fā)展，已經(jīng)成為冠心病和心力衰竭治療、研究的熱點，為終末期心臟病患者的治療帶來了新的希望[9-11]。骨髓干細胞移植的優(yōu)勢在于其取材簡便，從自體采集，避免了胚胎干細胞所面臨的倫理學糾紛和免疫排斥反應，且可形成有效的電—機械耦聯(lián)，彌補了骨骼肌干細胞的不足，因此骨髓干細胞是最具優(yōu)勢的移植細胞來源[12-13]。

本研究運用血管內(nèi)皮生長因子基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植對急性心肌缺血大鼠進行干預，結(jié)果顯示：觀察組大鼠左心室功能、血管再生情況、鏡下左心室病理改變均明顯優(yōu)于對照組，提示，骨髓干細胞移植的有效性。血管內(nèi)皮生長因子是一種最重要的成血管因子，其主要作用在于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞外基質(zhì)溶解、遷移、增生和管腔形成、刺激多種細胞增殖，延緩衰老，抑制凋亡，改善存活等，促進血管生成[14]。

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