TFPI-2在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義*

盧建國 趙香梅 趙寶生 齊博

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，食管癌中鱗癌最常見，約占食管癌的90%。我國是全世界食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家。隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)水平的不斷提高，手術(shù)方法的不斷改進(jìn)，切除率顯著提高，手術(shù)死亡率也大大降低，但5年生存率仍在30%~40%之間徘徊。食管癌預(yù)后差的主要原因是由于腫瘤對(duì)周圍組織的侵襲，以及在腫瘤早期就發(fā)生鄰近組織和遠(yuǎn)端組織的轉(zhuǎn)移。TFPI-2即組織因子途徑抑制物2，是一種絲氨酸蛋白酶抑制物，可抑制纖溶酶、胰蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等多種蛋白酶活性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TFPI-2通過抑制MMPs等多種機(jī)制，降低腫瘤的侵襲能力，在抑制腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本來自2009年4月-2010年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科食管鱗癌患者行根治性切除病例。選擇臨床病理資料完整的52例食管鱗癌病例、28例癌旁（3 cm<距腫瘤邊緣<5 cm）病例為研究對(duì)象；同時(shí)選擇28例食管鱗癌切除標(biāo)本上、下斷端（距腫瘤邊緣>5 cm）的正常食管組織作為正常對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人VEGFR-3多克隆抗體：購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司 （1：100）。兔抗人TFPI-2多克隆抗體：購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司（1：200）。通用型SP-9000檢測(cè)試劑盒（549257A）：購自北京中杉金橋公司；3，3-二氨基對(duì)二氨基聯(lián)苯（3，3-Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（549257A）：購自北京中杉金橋公司。

1.2.2 免疫組化染色步驟（SP法）（1）切片烤片后常規(guī)二甲苯脫蠟，遞減梯度酒精（無水乙醇、95%酒精、80%酒精I(xiàn)、II）各3 min脫蠟至水。（2）新鮮配制3%H202，于室溫下避光浸泡10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。（3）PBS液洗3次，每次5 min。（4）檸檬酸緩沖液浸泡，微波修復(fù)（高火加熱至沸騰后，降至低火，加熱共20 min后，自然冷卻至室溫）。（5）PBS液洗3次，每次2 min。（6）滴加通用型的正常山羊血清工作液室溫下與濕盒中封閉10 min。（7）PBS液洗3次，每次5 min。（8）滴加一抗：A兔抗人VEGFR-3多克隆抗體：購自上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司（1∶100）。置于濕盒中4 ℃過夜，B兔抗人TFPI-2多克隆抗體：購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司（1∶200），置于冰箱中4 ℃過夜。（9）PBS液洗3次，每次5 min。（10）每張切片滴加1滴（約 50 μL）二抗（1%BSA-PBS），37℃下孵育20 min。（11）應(yīng)用DAB溶液顯色，鏡下控制染色時(shí)間。（12）自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染。（13）梯度酒精脫水。（14）二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，根據(jù)資料類型分別采用 字2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、方差分析及Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFPI-2在食管鱗癌組織、癌旁組織和正常食管組織中表達(dá) 陽性指數(shù)=（TFPI-2陽性染色面積/視場(chǎng)面積）×100%。TFPI-2表達(dá)陽性指數(shù)在食管鱗癌組織、癌旁組織、正常食管組織中分別為（16.25±9.57）%、（22.41±7.24）%、（27.76±5.30）%。三組間比較，F(xiàn)=19.233，P=0.000；鱗癌組織與癌旁組織比較，P=0.015；鱗癌組織與正常食管組織比較，P=0.000；癌旁組織和正常食管組織比較，P=0.002。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 癌組織中TFPI-2的表達(dá)與各臨床病理因素之間的關(guān)系 食管鱗癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大小、浸潤深度、TNM分期及腫瘤的分化程度與TFPI-2的表達(dá)陽性指數(shù)則呈負(fù)相關(guān)（rs分 別 =-0.315、-0.444、-0.647、-0.772、-0.292）。 見表1。

表1 TFPI-2與食管癌臨床、病理之間的關(guān)系

3 討論

TFPI-2，過去又叫胎盤蛋白5（placenla protein 5，PPS），基因位于人類染色體7q22，全長約7.0 kb，整個(gè)TFPI-2基因由5個(gè)外顯子（由羅馬數(shù)字指定）和4個(gè)內(nèi)含子（由字母命名）組成。是一種相對(duì)分子量為32 kDa的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由多種細(xì)胞合成并定向分泌到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），它是介導(dǎo)或調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解和重塑的質(zhì)粒[1，4-5]。TFPI-2蛋白的4級(jí)結(jié)構(gòu)中包含有能夠抑制多種絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)元件，其反應(yīng)活性部位能與多個(gè)絲氨酸蛋白酶（糜蛋白酶、纖溶酶、纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶、FXa、血漿激肽釋放酶及基質(zhì)金屬蛋白酶等）對(duì)應(yīng)的活性位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)這些酶的活性起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[4]，纖溶酶及基質(zhì)金屬蛋白酶家族參與了ECM的降解和重塑，大量研究表明這些絲氨酸蛋白酶在腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，腫瘤組織中新生血管生長、傷口愈合、血栓的溶解吸收及等病理生理過程中發(fā)揮了重要作用[4-5]。降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步，而TFPI-2蛋白保護(hù)ECM不被降解，維持ECM結(jié)構(gòu)完整性，一些侵襲性比較強(qiáng)的腫瘤組織中TFPI-2的表達(dá)顯著下調(diào)。Miyagi等[6]1996檢出TFPI-2基因定位于染色體的7q22，7號(hào)染色體的缺失常見于多種腫瘤，包括小細(xì)胞肺癌、胃腺癌以及骨髓瘤等多種惡性腫瘤，提示TFPI-2基因的改變參與了腫瘤的演進(jìn)。腫瘤組織中TFPI-2的下調(diào)也可能是TFPI-2基因序列中的CpG被甲基化后促使其基因的轉(zhuǎn)錄沉默而實(shí)現(xiàn)的[7]。TFPI-2基因還被認(rèn)為是一種抑癌基因，而CpG島是該基因調(diào)控的主要位點(diǎn)。Miyagi等[8]報(bào)道在九種胰腺癌細(xì)胞株中TFPI-2基因序列中的CpG甲基化發(fā)生率為77.8%。

在食管鱗癌中，基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而TFPI-2作為基質(zhì)水解酶抑制劑表達(dá)下調(diào)[9-10]。TFPI-2表達(dá)的下調(diào)可能促進(jìn)食管癌鱗癌細(xì)胞惡性行為的發(fā)展。因此TFPI-2表達(dá)陽性指數(shù)在正常食管上皮、癌旁組織、癌組織中的表達(dá)指數(shù)呈遞減趨勢(shì)，差異極顯著（P<0.05）。

TFPI-2在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[11-13]，在多數(shù)腫瘤中TFPI-2表現(xiàn)出抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。食管鱗癌細(xì)胞無論是局部生長還是通過血道或者淋巴管道形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或?qū)χ車M織侵襲，首先都要降解或破壞細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致TFPI-2表達(dá)下調(diào)[14-15]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示食管鱗癌中TFPI-2的表達(dá)陽性指數(shù)明顯下降，其陽性指數(shù)與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、腫瘤大小、分化程度、TNM分期呈負(fù)相關(guān)。

目前關(guān)于TFPI-2與食管鱗癌的關(guān)系少有報(bào)道，但是根據(jù)TFPI-2在細(xì)胞外基質(zhì)中的作用及食管鱗癌細(xì)胞的特性，有理由相信，在食管鱗癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中TFPI-2扮演了重要的角色，其具體作用機(jī)制是否也是TFPI-2基因序列中的CpG甲基化導(dǎo)致的，尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使得對(duì)食管鱗癌中TFPI-2下調(diào)機(jī)制的研究提供了可行性探索，也為改善食管鱗癌的預(yù)后和尋找新的治療切入點(diǎn)提供了線索。

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