黃芩素對喉癌Hep-2細胞增殖的抑制作用*

孫吉鳳 劉劍凱 張淑芳

黃芩素（baicalein，BAI）是從傳統中藥黃芩的根中提取出的一種主要有效成分，它屬于黃酮類化合物[1]。一些以黃芩素作為主要成分的制劑應用于抗菌、抗病毒、抗過敏、抗血栓等多種方面疾病的治療[2-3]。近幾年來，一些研究表明，黃芩素可以抑制胰腺癌、皮膚癌、宮頸癌細胞等的增殖，誘導凋亡[4-6]，但具體作用機制尚待深入研究。喉癌是一種常見的頭頸部鱗狀細胞癌，具有預后不良、高死亡率等特點，局部發生轉移的患者又以預后不良、高死亡率為特點[7-10]。目前國內外尚未見黃芩素對喉癌的抑制作用相關研究。本實驗擬對不同濃度黃芩素對人喉癌Hep-2細胞的生長抑制和誘導凋亡作用進行研究，從而為進一步闡明黃芩素的抗癌機制及臨床應用提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人喉癌Hep-2細胞購于上海細胞生物研究所。黃芩素（Baicalein）購于美國SIGMA公司，用DMSO溶解后配成貯存液置于-20 ℃冰箱保存，實驗時稀釋至所需濃度。胎牛血清、四甲基偶氮唑藍（MTT）、臺盼蘭和吖啶橙（AO）購于北京鼎國生物技術公司。RPMI1640培養基購于GIBCO/BRL公司。

1.2 細胞培養 喉癌細胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS（經56 ℃ 30 min滅活），100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，單層細胞培養；37 ℃ 5% CO2孵箱中培養傳代，每次傳代均以0.25%胰蛋白酶消化，洗滌一次，更換新培養基。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數期生長的Hep-2細胞按每孔5×103個細胞接種于96孔培養板中，用5%FBS的RPMI1640培養液培養24 h后，更換成無血清的RPMI1640培養液同步化培養24 h，再更換成5%FBS的RPMI1640培養液，并加入黃芩素（10、20、40、80 μmol/L），每組藥物濃度設5個復孔，同時設不加藥物的陰性對照（加入溶劑DMSO）和不接種細胞的空白對照。在CO2孵箱中分別培養24 h及48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續孵育4 h后，棄上清液，加入150 μL DMSO， 輕輕振蕩10 min，等結晶物完全溶解后，利用酶標儀，在570 nm波長處檢測各孔A值，按細胞增殖抑制率（%）=（1-藥物處理組A570值/陰性對照組A570值）×100%計算藥物對細胞增殖的抑制率。

1.4 臺盼蘭染色法檢測細胞活力 取對數期生長的Hep-2細胞，按每孔5×103個細胞接種于24孔培養板中，每孔1 mL，5%FBS的RPMI1640培養液培養24 h后，更換成無血清的RPMI1640培養液同步化培養24 h，最后再更換成5%FBS的RPMI1640培養液，并加入終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素1 μL，每組藥物濃度設5個復孔，同時設不加藥物的陰性對照（加入溶劑DMSO）。細胞加藥后置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育48 h后，制成單細胞懸液。再用0.4%的臺盼蘭染色，染色2~3 min，并在光學顯微鏡下計數拒染的活細胞。每瓶取5個視野，數100個細胞，計數該視野內的活細胞數和死細胞數；實驗重復5次，求平均值，并計算細胞活力=平均活細胞數/（平均活細胞數+平均死細胞數）。

1.5 吖啶橙染色法檢測細胞凋亡 采用吖啶橙（acridine orange，AO）染色法觀察黃芩素對Hep-2細胞形態的影響。取對數期生長的Hep-2細胞，以4×104細胞數接種于24孔板中，5%FBS的RPMI1640培養液培養24 h后，更換成無血清的RPMI1640培養液同步化培養24 h，最后再更換成5%FBS的RPMI1640培養液，并加入終濃度為40 μmol/L及80 μmol/L的黃芩素，每組藥物濃度設5個復孔，同時設不加藥物的陰性對照（加入溶劑DMSO）培養48 h后，取出載玻片，PBS洗兩次，滴加0.01%的吖啶橙，在熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并照相。

1.6 統計學處理 用SPSS 13.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析，計量資料以（x-±s）表示，重復測量的計量資料采用方差分析，其他用單因素方差分析或t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對Hep-2 細胞增殖的影響 圖1為黃芩素（10、20、40、80 μmol/L）作用24、48 h后，對各組細胞增殖的影響。其中24 h作用組中，各濃度的抑制率分別為（8.23±0.05）%、（19.48±0.04）%、（53.85±0.07）%、（86.54±0.04）%，組間比較差異具有統計學意義（P<0.05）；48 h作用組中，各濃度的抑制率分別為（14.52±0.11）%、（34.13±0.06）%、（69.85±0.03）%、（96.43±0.02）%，組間比較差異具有統計學意義（P<0.05）；說明不同濃度的黃芩素作用于腫瘤細胞，在一定濃度范圍內（10~80 μmol/L），隨劑量增加，黃芩素對Hep-2細胞增殖的抑制率增加，呈劑量依賴性。同時48 h作用組與24 h作用組，在不同濃度下的抑制率之間比較差異具有統計學意義（P<0.05），說明隨著時間的延長，黃芩素的抑制增殖效應逐漸增強，呈時間依賴性。

圖1 黃芩素（BAI）對Hep-2細胞增殖的影響

2.2 黃芩素對Hep-2細胞活力的影響 陰性對照組（DMSO）Hep-2細胞無藥物刺激，細胞呈對數增長，在24、48 h內存活率無明顯變化，均大于98%。表1為終濃度為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素作用24、48 h后，臺盼蘭染色法的各組細胞計數后的統計分析結果。實驗表明，與陰性對照組相比，不同濃度的黃芩素作用于Hep-2細胞，在一定濃度范圍內（10~80 μmol/L），以時間-劑量依賴方式抑制Hep-2 細胞活力，差異有統計學意義（P<0.05）。

表1 黃芩素（BAI）對Hep-2細胞活力的影響（±s，n=5）

表1 黃芩素（BAI）對Hep-2細胞活力的影響（±s，n=5）

*與陰性對照組（加入溶劑DMSO）比較，P<0.05

B A I濃度 2 4 h 4 8 h陰性對照組（D M S O）9 8.6 5±0.2 3 9 8.0 0±0.0 4 1 0 μ m o l/L 7 8.0 0±0.2 5* 7 6.0 0±0.1 5*2 0 μ m o l/L 6 4.0 0±0.1 2* 5 3.0 0±0.3 1*4 0 μ m o l/L 3 6.0 0±0.1 8* 3 0.0 0±0.1 2*8 0 μ m o l/L 1 6.7 0±0.2 7* 9.4 0±0.1 8*

2.3 黃芩素對Hep-2細胞形態的影響 陰性對照組（加入溶劑DMSO）和終濃度為40、80 μmol/L的黃芩素作用于Hep-2細胞48 h后，經吖啶橙染色后，在熒光顯微鏡下放大40倍后觀察細胞形態見圖2。由圖2可見，陰性對照組細胞處于完全貼壁狀態，并且形態完整，具有偽足；終濃度為40 μmol/L的黃芩素作用48 h后，細胞的偽足已收縮，細胞質萎縮，出現凋亡小體；終濃度為80 μmol/L的黃芩素作用48 h后，因更多細胞壞死使得細胞相對更少，細胞近似卵圓形，細胞質萎縮，有凋亡小體，甚或見黃綠色碎片。

圖2 AO染色法觀察黃芩素對喉癌Hep-2細胞形態的影響（×40）

3 討論

近年來研究表明，黃芩素作為中藥黃芩的主要活性成分，還具有抗腫瘤作用。黃芩素對人白血病HL-60細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人皮膚癌細胞等有明顯的增殖抑制作用[11-13]，并與促進腫瘤細胞凋亡有關。本實驗對黃芩素對人喉癌Hep-2細胞的增殖、細胞活力及其誘導凋亡細胞形態展開研究。

本研究通過MTT法表明，終濃度為10、20、40、80 μmol/L的黃芩素，在作用24、48 h后，對人喉癌Hep-2細胞增殖具有抑制作用，且隨濃度及作用時間增加，抑制率也增加，最高可達（96.43±0.02）%。說明終濃度為10~80 μmol/L的黃芩素在作用24、48 h后，對喉癌Hep-2細胞存在時間-劑量依賴的增殖抑制作用（P<0.05）。這與王竹君等[14]及張淑群等[15]對人食管腺癌OE33細胞及人乳腺癌MDA-MB-231細胞的研究結果相近。臺盼蘭染色法，是利用臺盼蘭對細胞膜受損的死細胞進行染色來研究藥物對細胞活力影響的一種方法。通過本研究表明，終濃度為10~80 μmol/L黃芩素作用24 h后，使得Hep-2細胞活力由陰性對照組（加入溶劑DMSO）的（98.65±0.23）%降低到（16.70±0.27）%，作用48 h后，使得Hep-2細胞活力由陰性對照組（加入溶劑DMSO）（98.00±0.04）%降低到（9.40±0.18）%，說明對喉癌Hep-2細胞活力的抑制呈時間-劑量依賴性（P<0.05）。利用堿性熒光染料AO染色法，從形態學的角度檢測到，終濃度為40、80 μmol/L的黃芩素作用48 h后，使得細胞偽足收縮，出現凋亡細胞，因細胞死亡使得貼壁細胞數明顯減少。說明黃芩素（40、80 μmol/L）作用48 h，可誘導喉癌Hep-2細胞凋亡。

綜上所述，黃芩素可顯著抑制人喉癌Hep-2細胞的增殖、抑制細胞活力，誘導細胞凋亡。這些發現是對黃芩素在腫瘤細胞抑制作用方面的突破性認識，拓展了對黃芩素抗癌機制的研究。黃芩素作為一種藥源充足、安全有效、價格低廉的中藥成分，相信其在抑制喉癌方面將具有廣闊的應用。此外，還需進一步對黃芩素抑制喉癌細胞增殖及誘導凋亡等的分子機制進行多方面的深入研究。

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