四川達州地區山羊偽結核棒狀桿菌病的診斷及藥敏試驗

張夢思，李和賢，周作勇

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶榮昌402460）

四川達州地區山羊偽結核棒狀桿菌病的診斷及藥敏試驗

張夢思，李和賢，周作勇

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶榮昌402460）

自2014年以來，四川達州地區眾多羊場所飼養的山羊皮膚出現“長包”現象，有的羊場發病率甚至高達30%，但該病致死率很低。隨著該病在羊群中越來越多，很難徹底根除，且導致山羊生產性能明顯降低，才引起飼主重視。2015年5月，筆者對達州地區宣漢縣發病山羊采集病料，經實驗室確診為山羊偽結核棒狀桿菌病，進一步進行藥物敏感試驗，為該地區用藥提供指導，報告如下。

1 發病情況

不同品種的山羊均可發病，主要發生于3月齡以上，以成年羊為主，1～2月齡羔羊極少發生。患病羊多數呈慢性經過，主要在頭頸部、肩前、股前甚至乳房等處出現局灶性腫塊，俗稱“包”，其大小不一。隨著病情的發展，包塊逐漸腫脹、增大，大者可達鴨蛋大小，初期觸之較硬，之后開始化膿變軟，并有波動感，發展到后期淺表的膿腫自行破潰，流出乳白色濃稠的牙膏狀膿汁，膿汁排后數日傷口會痊愈，但常會在原處或者其周圍發生新的膿腫，整個病程大多為1個月左右，有的可達3個月。患病山羊極少發生死亡，部分發病羊表現為皮膚瘙癢，經常相互摩擦或在墻上摩擦，嚴重的病羊出現全身性感染，表現為咳嗽、食欲下降、體重下降。

2 實驗室診斷

2.1 病料采集以5mL無菌注射器從發病癥狀典型的兩頭波爾山羊膿腫中抽取膿汁（見中插彩版圖1），低溫送回實驗室待檢。

2.2 細菌分離培養將病料分別接種在普通營養瓊脂、普通營養肉湯、含10%犢牛血清的肉湯、麥康凱瓊脂和血平板瓊脂培養基上，37℃培養24～48 h，觀察菌落形態。結果：從所采集的兩個膿汁樣本中均分離出細菌（編號分別為XH-1和XH-2），細菌在普通營養瓊脂和普通營養肉湯內生長不良，但在含10%犢牛血清的肉湯內生長良好，接種24 h血清肉湯明顯變渾濁，且有白色菌膜出現，試管底有顆粒樣物質沉淀。分離菌在血瓊脂平板上生長良好，接種24 h出現針尖大小的菌落，48 h后出現1mm大小，灰白色、不透明、干燥、中央凸起、邊緣不整齊的菌落，菌落在培養基上附著不牢，鉑金耳易將其滑動卻難挑起，該菌在血平板上面出現狹窄β型溶血環，但傳代后不溶血。在麥康凱培養基上無細菌生長。

2.3 涂片鏡檢將培養物涂片進行革蘭染色鏡檢，可見大量球桿狀的革蘭陽性菌，無莢膜、鞭毛和芽孢，多呈散在分布，該菌的排列與葡萄球菌的排列頗為相似（見中插彩版圖2）。2.4細菌16S rDNA的擴增、測序及分析以細菌基因組提取試劑盒分別提取分離菌的基因組DNA，以16S rDNA通用引物（上游5′-AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-CGGCTACCTTGT?TACGACTT-3′）進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳。結果，兩個分離株均獲得長度約為1 500 bp的擴增片段（見中插彩版圖3）。將擴增的PCR產物送英濰捷基（上海）貿易有限公司測序，分別獲得的序列長度為1 398 bp和1 394 bp，經Blast在線比對分析，2株分離菌16S rDNA序列與Gen?Bank已收錄的偽結核棒狀桿菌（ATCC 19410，登錄號為NR_115562.1）相應的基因序列同源性最高，分別為98%和99%，結合兩株細菌的培養特性及染色特點確定分離菌為山羊偽結核棒狀桿菌。2.5致病性試驗取山羊偽結核棒狀桿菌在含10%犢牛血清肉湯的24 h純培養物進行試驗：（1）對小鼠的致病性試驗：將小鼠分為1個對照組，分離菌接種1組和2組，每組3只，分離菌接種組小鼠經腹腔注射對應菌液0.3mL，對照組注射含10%犢牛血清肉湯0.3mL。結果分離菌接種組小鼠在2 d內全部死亡，從死亡小鼠肝臟中分離獲得與接種菌一致的致病菌，而對照組小鼠仍健康存活。證實所分離的偽結核棒狀桿菌具有較強的致病性；（2）感染途徑試驗：取健康小白鼠10只，分灌胃組、滴鼻組、皮下注射組、腹腔注射組和對照組，每組2只。對照組腹腔注射10%犢牛血清肉湯，其余試驗組小鼠按相應途徑每只接種0.1mL菌液。結果腹腔注射的兩只小鼠在3 d內死亡；皮下注射的兩只在第8天左右注射部位開始膿腫，11 d左右自行破潰，流出黃綠色膿汁，13 d左右開始結痂愈合，病情發展快者在原處附近又開始發生新的膿腫，14 d將其致死剖檢發現其僅頸部淋巴結腫大，內部器官并無明顯眼觀病變；其余6只小鼠于14 d撲殺，剖檢發現灌胃的小鼠僅腸壁上有少量米粒大小的膿包，而滴鼻的小鼠在其腸壁、腎臟上面有米粒至豌豆大小不等的膿包，胸腺腫大。對照組小鼠無異常表現和剖檢病變。本試驗證實偽結核棒狀桿菌可以經多途徑感染發病。

2.6 藥敏試驗采用紙片擴散法進行藥敏試驗，用滅菌的涂布棒將100μL偽結核棒狀桿菌菌液均勻涂布在鮮血瓊脂培養基上，待菌液被完全吸收后，將不同的藥敏試驗貼在培養基的適當位置，37℃培養24 h，觀察記錄抑菌圈大小，判定依照美國CLSI標準。結果2株分離菌藥敏譜基本一致，大部分抗生素對偽結核棒狀桿菌均有一定的抑制作用，其中分離菌對四環素、氯霉素、諾氟沙星、米諾環素、頭孢西叮、克拉霉素及羅紅霉素等13種藥物高度敏感；XH-1和XH-2對甲氧嘧啶和頭孢曲松分別為中敏和高敏；對呋喃妥因和呋喃唑酮則表現為完全耐藥（表1）。

表1 偽結核棒狀桿菌藥敏試驗

3 討論

3.1 根據上述臨床癥狀，分離菌形態、培養特性，分離細菌16S rDNA序列的同源性比對結果，以及致病性特點，可判定該羊場山羊所患病為偽結核棒狀桿菌病。

3.2 羊偽結核棒狀桿菌病是由偽結核棒狀桿菌引起的一種人畜共患慢性傳染病，國外多稱之為干酪樣淋巴結炎（CLA）［1］。本病在世界上養羊的各個地區都普遍存在，我國內蒙古、陜西、甘肅、新疆、云南、貴州、上海、浙江、廣西和廣東等地均有報道［2］，而在四川省僅見攀枝花有過報道［3-4］。由于該病發病緩慢，且致死率一般較低，所以常常被人們忽視。據調查很多養殖場山羊首次發病時，養殖戶均會采取措施進行處理，如對發病羊注射抗生素，同時切開膿腫進行排膿清洗消包等，隨后發現該病不易造成死亡，很多情況下均不再做任何處理，而是讓膿瘡自行破潰、流膿結痂。因膿汁外流極易將病原傳播給同群山羊和污染環境，這也是該地區山羊偽結核棒狀桿菌病年年發生的重要原因。近年來，西南地區山羊養殖量快速增多，山羊偽結核棒狀桿菌病呈現出大面積流行，感染嚴重時可造成生產性能下降甚至死亡，加之該菌對人也有致病性，需引起人們的足夠重視。

3.3 羊偽結核棒狀桿菌病是難以治療的傳染病之一，一旦侵入羊群則很難徹底清除。目前，治療該病的方法主要有藥物和手術治療。用于該病防治的藥物包括多種抗生素和中草藥等，本次藥敏試驗結果證實，山羊偽結核棒狀桿菌對很多種抗生素敏感，這可能與該地區抗生素在山羊上使用較少有關。然而資料報道，多種抗生素在臨床上治療效果并不理想，其原因可能是：（1）包囊膜為一層厚而致密的纖維性肉芽腫，諸多藥物難以通過，無法滲入其內；（2）偽結核棒狀桿菌可寄生于細胞內，使得一些藥物對其難以發揮作用；（3）包囊內膿汁干稠，藥物難以均勻地擴散于整個膿腫，不能徹底殺死膿腫內的病原菌。因此，在對患羊進行藥物治療的同時，采取手術切開其膿腫排膿，清洗消毒，療效會更好。馬成貴等人用此法治療多例，均1次治愈［5］。

3.4 由于臨床用藥物防治羊偽結核棒狀桿菌病不理想，目前也無可有效防治該病的疫苗，因此采取綜合性的預防措施才是防治該病的根本。不要從有偽結核病史的羊場引種，隔離飼養并及時治療發病羊，嚴格消毒和清除病羊排出的膿汁，避免污染周圍場所及飼草。同時應視情況淘汰患羊以凈化羊群［6］。

［1］Seyfert N，Silva R F，Jardin J，etal.Serological proteome analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from different hosts reveals novel candidates for prophylactics to control caseous lymphadenitis［J］.Veterinary Microbiology，2014，174：255-260

［2］鄭敏，胡杰，歐紹毅，等.廣西黑山羊偽結核棒狀桿菌的分離與鑒定［J］.廣西農業科學，2010，41（10）：1128.

［3］楊應東，童俊青，陳明華，等.四川某圈養山羊場干酪性淋巴結炎病的調查與措施建議［J］.攀枝花科技與信息，2011，36（3）：46-47.

［4］曾澤，韋雷飛，黃秀君，等.一起山羊偽結核棒狀桿菌感染的診斷［J］.動物醫學進展，2014，35（3）：131-133.

［5］馬成貴，王小虎.山羊“長包”病防治的體會［J］.養殖技術顧問，2012，9：85.

［6］宋先利.山羊偽結核病的診治要點［J］.中國畜牧獸醫文摘，2013，29（6）：143.

S852.61+8

B

0529-6005（2015）12-0054-02

2015-7-24

中央高校基本科研業務費專項資金資助（XDJK20-15C030）；西南大學博士啟動基金（2013Bsr07）

張夢思（1995-），女，本科生，學習方向為動物醫學，E-mail：1418121852@qq.com

周作勇，E-mail：zzyxnny@163.com