舒泰麻醉對大鼠各腦區內源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影響

唐琦超，鄒 晶，李 妍，劉海玉，馮秀晶，李建男，范宏剛

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

舒泰麻醉對大鼠各腦區內源性H2S及胱硫醚β-合成酶的影響

唐琦超，鄒 晶，李 妍，劉海玉，馮秀晶，李建男，范宏剛

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

為研究舒泰麻醉對大鼠腦內源性H2S含量及其合成酶CBS的影響，借以探討內源性硫化氫及其合成酶CBS與麻醉之間的關系。將24只Wistar大鼠隨機分為對照組（C組），翻正反射消失組（Z1組）和翻正反射恢復組（Z2組）。各組于相應時間點取腦，使用亞甲藍染色法和Western Blot檢測各腦區內源性H2S含量及CBS蛋白表達量。結果顯示，Z1組腦干和海馬內H2S含量較C組均顯著降低，且腦干和海馬內CBS蛋白表達量較C組顯著降低，而丘腦內CBS蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）；Z2組腦干內H2S含量較C組顯著降低，而丘腦內CBS蛋白表達量較C組顯著升高，且海馬內H2S含量與CBS蛋白表達量較其他四個腦區均顯著升高（P＜0.05）。綜合實驗結果表明，舒泰與腦中內源性H2S及CBS的生成具有一定相關性。

舒泰；腦；內源性硫化氫；胱硫醚β-合成酶

舒泰（Zoletil）作為目前臨床上常用的犬貓全身麻醉劑，主要由唑拉西泮和替來他明（又名噻環乙胺）組成。舒泰已經被證明可以作用于谷氨酸能神經元和GABA能神經元［1］。谷氨酸作為谷氨酸能神經元的信號分子，由GABA能神經元釋放，可通過脫羧基作用生成GABA。硫化氫（H2S）一直都被認為是有毒氣體，但近年來研究發現，體內可產生內源性H2S，作為一種氣體信號分子，其在生理學和病理生理學中都具有重要意義。H2S發揮作用的分子靶點主要包括蛋白質、酶、轉錄因子以及膜離子通道。胱硫醚β-合成酶（CBS）是中樞神經系統內生成H2S主要的合成酶。前期實驗發現［2］，氯胺酮麻醉大鼠在注射外源性H2S后，其蘇醒時間明顯加快，表明硫化氫可加快氯胺酮麻醉蘇醒。而作為舒泰主要成分之一的替來他明，與氯胺酮為同類藥物，其藥理特性相似。因此本試驗擬通過對舒泰麻醉后大鼠各腦區內內源性H2S含量及其合成酶CBS蛋白表達量的檢測，借以探究舒泰麻醉在不同作用時間與CBS蛋白表達量可能存在的相關性并試述其可能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組試驗選取24只雌性Wistar大鼠，購自長春市伊斯實驗動物技術有限責任公司，體重200±20 g，試驗前一周置于室溫清潔環境安靜飼養，自由攝食飲水。將大鼠隨機分為對照組（C組）和舒泰麻醉組（Z組），其中舒泰麻醉組又被分為兩個亞組，即翻正反射消失組（Z1組）和翻正反射恢復組（Z2組），各組均為8只大鼠。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣C組腹腔注射0.5mL生理鹽水；Z組大鼠按50mg/kg體重腹腔注射舒泰50（法國Vir?bac公司），使大鼠處于正常麻醉狀態，且在麻醉中保證其體溫、呼吸、血壓、血氧和心率均于安全范圍內。其中Z1組和Z2組分別于翻正反射消失和翻正反射恢復后，C組直接斷頸取腦。將腦組織置于冰面并分離出大腦、海馬、腦干、丘腦及小腦5個腦區。一分為二，一半放入凍存管內，先于液氮中速凍，后轉移到-80℃保存。另一半取出待用。

1.2.2 亞甲藍染色法測定H2S含量將另一半腦組織按質量與體積比為1∶10的比例加入0.01mol/L PBS，于勻漿器內充分研磨后倒入EP管中，離心機中3 000 r/min（4℃）離心10min，取上清液待測。

量取上清液600μL，加入2 mmol/L磷酸鉀400μL，使整個體系的總體積為1 mL，隨后放入錐形瓶內充分反應，向其中加入0.5mL的1%醋酸鋅，氮氣在錐形瓶口充盈30 s后石蠟膜進行封口，隨后將錐形瓶轉移至37℃水浴中搖床90 min，加入50%三氯乙酸500μL使反應終止，37℃水浴60 min后將錐形瓶中的內容物轉移到含有3.5 mL dH2O的試管中，加20 mmol/L對苯二胺鹽酸鹽500μL和30 mmol/L三氯化鐵400μL，室溫孵育20 min后轉移至96孔板，用酶標儀于670 nm處測定吸光度。按照NaHS的標準濃度制作標準曲線，測出溶液中H2S含量。

1.2.3 Western Blot檢測各腦區CBS蛋白表達量（1）處理樣品：采用RIPA法裂解各腦區并提取腦組織中總蛋白，然后利用BCA法測定總蛋白濃度，按最終濃度為3μg/μL將樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性，待用；（2）電泳、轉膜及封閉：采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法：配置10%分離膠，5%濃縮膠，每孔上樣量均為30μg，使用Bio-Rad電泳儀，采取恒壓電泳，先80 V將溴酚藍跑至分離膠后，提高電壓到120 V將溴酚藍跑到底。采用恒流濕轉，用0.45 nm的PVDF膜，電流設定為300mA，轉膜時間為60min。轉膜完成后用5%脫脂奶粉封閉2 h；（3）一抗和二抗孵育：一抗選取兔抗CBS（Santa Cruz公司）1∶400稀釋，鼠抗β-ac?tin（北京中杉金橋生物技術有限公司）1∶400稀釋，稀釋液為5%脫脂奶粉，4℃過夜孵育。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗（Santa Cruz公司）1∶4 000稀釋，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）1∶6 000稀釋，稀釋液為TBST。二抗室溫孵育2 h；（4）顯影與數據處理：通過增強化學發光法（ECL），于暗室內利用X線膠片獲得目的條帶影像，經過顯影和定影后，將結果掃描進電腦后分析。使用Image J軟件計算灰度值，利用SPSS18.0軟件統計結果。

2 結果

2.1 各腦區內H2S含量舒泰麻醉大鼠翻正反射消失后，腦干內H2S含量較C組顯著降低9.86%，海馬內H2S含量較C組顯著降低15.74%；翻正反射恢復后，腦干內H2S含量較C組顯著降低8.31%，且海馬內H2S含量較其他4個腦區均顯著增多。

表1 舒泰麻醉對不同腦區內H2S含量的影響（-X±S，n=8）

2.2 各腦區內CBS蛋白表達量如表2和圖1所示，使用舒泰大鼠在其翻正反射消失后，腦干和海馬內CBS蛋白表達量相較于C組差異顯著且分別降低18.03%和34.42%，而丘腦內CBS蛋白表達量顯著升高81.94%；待翻正反射恢復后，丘腦內CBS蛋白表達量與C組相比顯著升高75%，且海馬內CBS蛋白表達量較其他四個腦區顯著升高。

3 討論

內源性硫化氫在體內合成主要通過3條途徑，即胱硫醚β-合成酶（CBS）途徑，胱硫醚γ-裂解酶（CSE）途徑以及3-巰基丙酮酸硫轉移酶（3-MST）途徑。其中CBS主要分布在大腦、周圍神經系統、肝臟和胰腺；CSE以主動脈、腸系膜動脈、門靜脈及其他血管組織為主；而3-MST作為近年來被發現的第3種合成H2S的相關酶，主要也分布于大腦內。CBS和CSE主要位于胞質內，而3-MST主要存在于線粒體內［3］。目前對內源性硫化氫的研究大多都集中在其可以增加谷胱甘肽含量從而起到抗氧化應激損傷作用，對心血管損傷的細胞保護作用以及起到松弛平滑肌的作用，但探討內源性硫化氫與麻醉相關性的研究相對較少。

表2 舒泰麻醉對不同腦區內CBS蛋白表達量在不同作用時間的影響（-X±S，n=8）

圖1 舒泰麻醉對不同腦區內CBS蛋白表達的影響

從上述結果中發現，使用舒泰麻醉后不同時刻，大鼠各腦區中內源性H2S含量和CBS蛋白表達量的變化也各不相同。因此有理由認為，舒泰能影響大鼠腦中內源性H2S含量及CBS蛋白表達量的變化。研究發現［1］，舒泰可影響腦內的谷氨酸濃度。谷氨酸是中樞神經系統中最重要的興奮性神經遞質，谷氨酸作為谷氨酸能神經元的信號分子，是GABA的前體，它可以由GABA能神經元釋放。存在于大腦皮層和海馬錐體細胞發出的下行通路內，可參與神經元之間興奮性突觸傳遞，而由于缺乏細胞外的代謝途徑，谷氨酸被釋放到突觸間隙后被星形膠質細胞上的谷氨酸轉運體所攝取，轉化為谷氨酰胺后作為合成谷氨酸和GABA的原料［4-5］。替來他明能夠引起大腦皮層抑制性神經遞質GABA含量顯著升高［6］。H2S可以引起Ca2+進入星形膠質細胞并向周圍傳播，形成鈣波，在神經元和星形膠質細胞之間相互作用，神經元引起周圍的星形膠質細胞的激活，從而調節突觸活動［7］。因此，從實驗結果中海馬內源性H2S含量在翻正反射消失時降低而后在翻正反射恢復時升高這一現象，我們可以假設其變化是因為舒泰中的替來他明能引起海馬內谷氨酸含量的升高，進而使內源性H2S參與星形膠質細胞內谷氨酸代謝通路的激活，促進GABA生成，從而起到鎮靜、催眠的作用，而后由于翻正反射恢復，GABA含量逐步降低。因為內源性H2S可能參與了這一反應過程，這也就為海馬內其含量先降低后升高提出一個較為合理的解釋。但就目前試驗結果來看，仍無法對腦干和丘腦內H2S和CBS含量變化的原因提出合理的解釋，需進一步試驗，用以研究其可能存在的機制。

4 結論

舒泰發揮全麻作用可能與抑制海馬、腦干和大腦皮層中H2S及CBS含量有關，腦內內源性H2S及CBS可能參與了舒泰全身麻醉的調控。

［1］Lee Y A，Kim J-I，Lee J-W，etal.Effects of Various Anesthetic Protocols on F-18-Flurodeoxyglucose Uptake into the Brains and Hearts of Normal Miniature Pigs（Sus scrofa domestica）［J］.Jour?nal Of the American Association for Laboratory Animal Science，2012，51（2）：246-252.

［2］范宏剛，馮國峰，郭蔚，等.外源性H2S對氯胺酮全麻大鼠麻醉時間、麻醉效果的影響［J］.東北農業大學學報，2013，44（12）：78-83.

［3］Predmore B L，Lefer D J，Gojon G.Hydrogen sulfide in biochem?istry and medicine［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：119-140.

［4］楊曉運，李智，秦綠葉，等.星形膠質細胞和神經元之間谷氨酸-谷氨酰胺的代謝偶聯［J］.生理科學進展，2003，34（4）：350-352.

［5］方琦.腦內組胺及H1受體對星形膠質細胞谷氨酸代謝通路的調控作用［D］.杭州：浙江大學，2013.

［6］張燕.噻環乙胺及小型豬復合麻醉劑（XFM）對大鼠不同腦區神經遞質含量的影響［D］.哈爾濱：東北農業大學，2010.

［7］Kimura H，Shibuya N，Kimura Y.Hydrogen Sulfide Is a Signaling Molecule and a Cytoprotectant［J］.Antioxidants&redox signaling，2012，17（1）：45-57.

Effect of Zoletil on endogenous hydrogen sulfide and cystathionine β-synthase in rat different encephalic regions

TANGQi-chao，ZOU Jing，LIYan，LIU Hai-yu，FENG Xiu-jing，LIJian-nan，FAN Hong-gang
（College of AnimalMedicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

In order to study the effectof Zoletil on endogenous hydrogen sulfide（H2S）and cystathionineβ-synthase（CBS）in rat different encephalic regions，and explore the correlation among them，24W istar rats were divided random ly into control group（groupC），disappearance of righting reflex（groupZ1）and recovery of righting reflex（groupZ2）.The brain tissues were taken when reaching each time point.The endogenous H2Scontents and CBSprotein expression in differentencephalic regionswere ana?lyzed bymethylene blue staining and western blot.The results showed that the H2S contents and CBS protein expression in groupZIwere significantly decreased in brainstem and hippocampus，and the CBSprotein expression was significantly increased in thala?mus（P＜0.05）.In groupZ2，the H2S contentswere significantly decreased in brainstem，and CBS protein expression was signifi?cantly increased.The H2S contents and CBS protein expression in hippocampuswere significantly increase than those in other en?cephalic regions（P＜0.05）.The results indicate that Zoletil is related with the emergence of endogenoushydrogen sulfide and cysta?thionineβ-synthase in brain.

Zoletil；brain；endogenous hydrogen sulfide；cystathionineβ-synthase

FAN Hong-gang

S865.1+3

A

0529-6005（2015）12-0100-03

2014-06-18

國家自然科學基金項目（31001092）

唐琦超（1988-），男，碩士生，主要從事動物麻醉研究，E-mail：tang19880205@126.com

范宏剛，E-mail：fanhonggang2002@163.com