昆侖雪菊黃酮提取物體外抗氧化活性試驗

徐 斌，王 丹，葛紅娟，宋春梅

（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

昆侖雪菊黃酮提取物體外抗氧化活性試驗

徐 斌，王 丹，葛紅娟，宋春梅

（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

為了研究昆侖雪菊黃酮提取物（KFE）體外抗氧化活性，采用超聲法提取昆侖雪菊中黃酮，乙醇濃度95%、溫度40℃、時間15 min，提取3次。經過測定1 g昆侖雪菊粉末中含有0.125 g黃酮。分別用普魯士藍還原法、水楊酸法、鄰苯三酚自氧化法、DPPH法以及硫代巴比妥酸法測定不同濃度下KFE的還原能力，對羥自由基（·OH）、超氧陰離子（O2-）、DPPH自由基的清除能力以及對脂質過氧化的抑制率。結果表明，KFE還原能力隨濃度上升而增強，但弱于維生素C；對羥自由基清除能力在110 g/mL最強，清除率為18.72%，高于維生素C；清除超氧陰離子的能力弱；DPPH自由基清除能力在302.5 g/mL最強，清除率為94.47%；脂質體系抗氧化能力在605 g/mL最強，抑制率為54.22%。結果表明，KFE具有一定的抗氧化活性。

昆侖雪菊；黃酮；抗氧化

昆侖雪菊又名天山雪菊、冰山雪菊、高寒香菊，生長于海拔3 200m以上的高寒山區，是惟一與雪蓮齊名且具有獨特功效的稀有高寒野生植物。由于產地污染少，兼之含有糖類、黃酮類、皂苷類、有機酸、鞣質、揮發油或油脂類［1］等多種活性成分，使其具有清熱解毒、活血化瘀和健胃脾、降血糖、糖耐受、降血脂、降血壓、抗氧化、抗凝血等功效［2］，其中黃酮類化合物（flavonoids）含量最為豐富。黃酮類化合物是一類廣泛分布于植物界的多酚類化合物，主要存在于植物的葉、花、根、莖、果實中，是植物在長期自然選擇過程中產生的一類次級代謝產物。據研究發現，黃酮對防癌抗癌、抗腫瘤、防心血管疾病、防骨質疏松、消除自由基和抗氧化活性、雌激素和抗雌激素樣作用等均有積極影響［1］，得到國內外專家學者的廣泛重視。隨著對抗氧化劑的認識，國內外學者對于植物中存在的天然抗氧化劑的研究越來越多。國內外關于昆侖雪菊的結構解剖學研究及其化學成分的研究已有報道［3-4］，但有關其系統抗氧化活性分析很少。本文主要探討昆侖雪菊黃酮提取物體外抗氧化活性［5-7］。通過測定昆侖雪菊黃酮提取物的還原能力、對自由基清除能力和對脂質體系抗氧化能力，并通過與抗壞血酸的對比來研究其抗氧化活性，為昆侖雪菊作為天然抗氧化劑和藥用植物提供一些理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料新疆昆侖山脈昆侖雪菊。

1.2 儀器與試劑FZ102微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；202-1AB電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-100DB數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TD5A離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；722可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；HHS電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；90-2定時恒溫磁力攪拌器（上海精科實業有限公司）；試劑為市售分析純。

1.3 蘆丁標準曲線繪制蘆丁標準溶液：精確稱取經干燥恒重的蘆丁標準品7.5mg，加甲醇溶解并定容至100mL，配成75μg/mL蘆丁標準溶液。

繪制標準曲線：準確吸取75μg/m L的蘆丁標準溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL（相當于含蘆丁0、37.5、75、150、225、300μg），移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5 mL，各加質量分數5%NaNO2溶液0.3mL，振搖后放置5min，加入質量分數10%Al（NO3）3溶液0.3 m L搖勻后放置6 min，加質量分數4%NaOH溶液2 mL，再加30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min。以零管溶液作參比溶液，于510 nm波長處測定各管吸光度值，以蘆丁含量（μg）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1。

試驗所得蘆丁標準曲線為y=0.0012x-0.0002，該曲線的相關系數R2=0.9999。

圖1 蘆丁標準曲線

1.4 原料中黃酮提取及體外抗氧化活性測定用微型植物粉碎機將昆侖雪菊粉碎，過60目網篩，得到昆侖雪菊粉末。準確稱取昆侖雪菊粉末1 g（3份），加入15 mL 95%乙醇液，40℃、80W超聲提取15min，以3 000 r/min離心10min，取上清液；將沉淀繼續加入15mL 95%乙醇液，于40℃、80W重復超聲提取15min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液；如此重復3次，合并3次上清液。旋轉蒸發濃縮后，用95%乙醇溶解定溶于100mL容量瓶中，作為原液備用［8-11］。

取昆侖雪菊黃酮提取物原液0.1mL稀釋定容至100 m L，取1m L稀釋后的提取液，按標準曲線制備操作步驟于510 nm處測定吸光度值。根據標準曲線計算得到1 g昆侖雪菊提取物中黃酮含量為0.125 g。之后分別采用普魯士藍還原法測定KFE和維生素C的還原能力［7］，水楊酸法［12-14］、鄰苯三酚自氧化法［12-14］、DPPH法［14］測定KFE和維生素C對羥自由基、超氧陰離子、DPPH自由基清除能力，硫代巴比妥酸法（TBS法）［15］測定KFE和維生素C的脂質體系抗氧化能力。

2 結果

2.1 昆侖雪菊黃酮提取物還原能力的測定采用普魯士藍還原法測定樣品的還原能力，吸光值越大，說明抗氧化性越好，還原能力越強。由圖2可知，昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C均具有良好的還原能力，并且其還原能力隨著樣品濃度的增加而增強，但昆侖雪菊黃酮提取物的還原能力較維生素C弱。

圖2 昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C的還原能力

2.2 昆侖雪菊黃酮提取物的羥自由基清除能力

由圖3可知，昆侖雪菊黃酮提取物具有一定的清除羥自由基的能力。在濃度為100μg/mL左右時，昆侖雪菊黃酮提取物對羥自由基的清除能力略強于維生素C，但隨著濃度增加昆侖雪菊黃酮提取物對羥自由基的清除能力逐漸減弱；而維生素C清除羥自由基的能力隨濃度升高而顯著增強，超過昆侖雪菊黃酮提取物。

圖3 昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C對羥自由基清除作用

2.3 昆侖雪菊黃酮提取物的超氧陰離子清除能力由圖4可知，昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C對超氧陰離子的清除作用比較。維生素C對超氧陰離子的清除率隨其濃度升高而不斷增強，而昆侖雪菊黃酮提取物對超氧陰離子的清除率呈負值，說明昆侖雪菊黃酮提取物可能不具有對超氧陰離子的清除能力。

圖4 昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C超氧陰離子清除率

2.4 昆侖雪菊黃酮提取物的DPPH自由基清除能力由圖5可知，昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C都具有較強的清除DPPH自由基能力，對DPPH自由基清除率在80%～100%之間，但是隨著樣品濃度增加，樣品對DPPH自由基清除率增長幅度并不大，昆侖雪菊黃酮提取物對自由基清除能力略低于維生素C。說明濃度對昆侖雪菊黃酮提取物清除DPPH自由基能力影響并不大，不同濃度的昆侖雪菊黃酮提取物均具有較強的清除能力。2.5昆侖雪菊黃酮提取物的脂質體系抗氧化能力由圖6可知，昆侖雪菊黃酮提取物具有一定的脂質體系抗氧化能力，當昆侖雪菊黃酮提取物濃度在100～500μg/mL之間，其對脂質過氧化抑制率在20%～30%之間，當濃度達到600μg/mL左右時，其脂質體系抗氧化能力迅速增強。由圖6可以看出，維生素C對脂質過氧化抑制率呈現負值，能夠說明其對脂質過氧化抑制作用較小。

圖5 昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C的DPPH自由基清除率

圖6 昆侖雪菊黃酮提取物和維生素C對脂質過氧化抑制率

3 討論

根據反應體系不同，昆侖雪菊黃酮提取物的抗氧化能力不同，總體上看，昆侖雪菊黃酮提取物具有還原能力，清除自由基的能力和脂質體系抗氧化的能力，說明昆侖雪菊黃酮提取物具有較全面的抗氧化活性。

通過普魯士藍法對還原能力的測定結果可以知道，昆侖雪菊黃酮提取物還原能力與其濃度大小存在一定的量效關系，隨著濃度的升高而增強。說明昆侖雪菊黃酮提取物具有較好的還原能力。

由水楊酸法對羥自由基清除能力的檢測結果可以看到，昆侖雪菊黃酮提取物對羥自由基有一定的清除能力，但其清除能力在到達一定的濃度后開始下降，在低濃度時，昆侖雪菊黃酮提取物對羥自由基的清除能力高于維生素C，而在濃度升高到一定程度后，其對羥自由基的清除能力遠不如維生素C。說明昆侖雪菊黃酮提取物對羥自由基有一定的清除能力。

由鄰苯三酚自氧化法對超氧陰離子清除能力的檢測結果可知，維生素C對超氧陰離子有較好的清除作用并隨濃度升高而增強，本次試驗未檢測出昆侖雪菊黃酮提取物對超氧陰離子的清除能力。說明昆侖雪菊黃酮提取物對超氧陰離子的清除能力弱，在較低濃度下不能表現出對超氧陰離子的清除作用。

通過DPPH法檢測對DPPH自由基清除能力的結果可知，昆侖雪菊黃酮提取物對DPPH的清除能力隨濃度上升的趨勢不明顯，但總體清除率較高；雖然其清除能力較弱于維生素C，但整體水平較高。說明昆侖雪菊黃酮提取物具有較好的清除DPPH自由基的能力。該結果與曹燕、龐市賓、徐磊等［14］的研究結果一致。

通過硫代巴比妥酸法對脂質體系抗氧化能力的檢測可知，昆侖雪菊黃酮提取物具有一定的脂質體系抗氧化能力在較低濃度時，它的抑制率沒有顯著變化，在到達一定濃度后，其抑制率明顯升高；維生素C的抑制率為負值，可能的原因是維生素C的濃度不夠高，在李穎暢、孟憲軍的研究［15］中用作對比的維生素C濃度在1mg/mL以上才顯示出其對脂質體系的抗氧化能力。說明昆侖雪菊黃酮提取物具有脂質體系抗氧化能力，且明顯強于同等濃度的維生素C。

本試驗的結果說明，昆侖雪菊具有較好的抗氧化活性，為將其作為一種天然抗氧化劑應用于食品、醫藥等方面提供一定的理論依據。

［1］延璽，劉會青，鄒永青，等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進展［J］.有機化學，2008，9：1534-1544.

［2］過利敏，張平，張謙，等.雪菊化學成分分析、提取、鑒定及其生物活性研究進展［J］.食品科學，2014，7：298-304.

［3］木合布力·阿布力孜，張燕，景兆均，等.新疆昆侖雪菊化學成分的初步定性研究［J］.新疆醫科大學學報，2010，6：628-630.

［4］蘭衛，趙保勝，李玉清，等.昆侖雪菊中多種成分的含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（10）：101-103.

［5］代沙.紫蘇葉抗氧化物質提取、含量測定及抗氧化活性研究［D］.雅安：四川農業大學，2013.

［6］張明，馮聰璐.抗氧化活性評價標準與發展［J］.安徽農學通報，2010，16（8）：33-34.

［7］劉暢，周家春.植物多酚抗氧化性研究［J］.糧食與油脂，2011，2:43-46.

［8］沙愛龍，吳瑛，盛海燕，等.昆侖雪菊黃酮對衰老模型小鼠腦及臟器指數的影響［J］.動物醫學進展，2013，7：66-68.

［9］吳瑛，劉天志，袁守亮.新疆高寒香菊總黃酮、多酚及水浸出物含量分析［J］.食品科技，2012，8：186-188+192.

［10］陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類化合物的提取方法研究概況［J］.生物質化學工程，2007，3：42-46.

［11］許剛，張虹，胡劍.竹葉中黃酮提取方法的研究［J］.分析化學，2000，7：857-859.

［12］賈征，黃文，薛安.杜仲葉黃酮的超聲提取及其抗氧化性研究［J］.安徽農業科學，2008，4：1286-1288.

［13］趙二勞，張海容，蓋青青，等.沙棘黃酮的測定及其抗氧化作用［J］.化學研究與應用，2003，2：284-285+256.

［14］曹燕，龐市賓，徐磊，等.金雞菊提取物體外抗氧化活性［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，12：144-147.

［15］李穎暢，孟憲軍.藍莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究［J］.營養學報，2008，4：427-429.

Studies on the Antioxidant Activity of Kunlun Snow Chrysanthemum Flavonoid Extracts in Vitro

XU Bin，WANGDan，GEHong-juan，SONGChun-mei
（School of public Health of Jilin Medical college，Jilin 132013，China）

In order to investigate the antioxidantactivity of Kunlun snow chrysanthemum flavonoid extracts（KFE）in vitro，flavonoid extracts of Kunlun snow chrysanthemum was extracted by ultrasonication in 95%ethanol at 40℃for 15min three times.One gram Kunlun snow chrysanthemum powder contained 0.125 g flavonoid.Then，the reduction ability，scavenging rate to hydroxyl radical（·OH），superoxide radicals（O2-）and DPPH，and the inhibition rate to lipid peroxidation of different concentration of KFEwere determined by Prussian Blue，salicylic acidmethod，pyrogallol autoxidationmethod and DPPHmethod.The results showed that the reduction ability of KFEwas increased with increased concentrations，but lower than Vc.Scavenging rate to·OH was 18.72%，which was thebestat the concentration of 110 g/mL.The ability of scavenging superoxide radicalswasweaker.The ability of scavenging DPPH was the bestat the concentration of 110 g/mL，and the scavenging rate was 94.47%.The ability to inhibiting lipid peroxidation was the bestat the concentration of 605 g/mL，and the inhibit ratewas 54.22%.KFE showed antioxidantactivity.

Kunlun Snow Chrysanthemum；Flavonoid；Antioxidant

SONGChun-mei

S11

A

0529-6005（2015）12-0103-04

2015-08-26

吉林省科技廳重點科技攻關項目，抗氧化功能保健食品“長白參莓顆粒”的研究（20140204069YY）

徐斌（1972-），男，副教授，碩士，研究方向為抗氧化及保健食品研究開發，E-mail：xb-jl@163.com

宋春梅，E-mail：1209816131@qq.com