市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

藺 露，姚 璐，孫 燕，謝建華，葉潔瑩，張 雪，盧 露

（1.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶渝北401120；2.西南大學，重慶北碚400715）

市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

藺 露1，姚 璐1，孫 燕1，謝建華1，葉潔瑩1，張 雪2，盧 露2

（1.重慶市動物疫病預防控制中心，重慶渝北401120；2.西南大學，重慶北碚400715）

大腸桿菌O157:H7是一種腸道出血性大腸桿菌（EHEC），屬于腸桿菌科埃希菌屬，該型具有很強的耐酸和耐低溫能力，可產生大量的Vero毒素引起人和動物出現腸出血性腹瀉，兒童與老人易感染出現此癥；嚴重時并發腎衰竭，病死率高，具有莢膜、鞭毛和菌毛；其最適生長溫度為30℃～42℃，且廣泛分布于自然界，人與人之間或人與家畜之間通過糞污染物經口途徑傳播。繼1982年美國首次發生EHEC引起人的食物中毒事件以后，腸出血性大腸桿菌造成的食源性或水源性污染問題正日益嚴重［1］。

為了解重慶、云南、陜西三省市的屠宰場、超市和農貿市場環境和畜禽肉產品中大腸桿菌O157:H7的污染情況，我們對3個省市12個屠宰場、7個超市和13個農貿市場的769份樣品進行了大腸桿菌O157:H7的分離與鑒定，獲得了1株大腸桿菌O157:H7菌株，命名為WL05D01。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2014年我們從重慶市的合川、江津、萬州、黔江、長壽、武隆以及陜西省的西安和云南省昆明采集樣本共769份，其中來自屠宰場、農貿市場、超市的豬肉樣品有173份、雞肉樣品184份、環境拭子樣品412份，見表1。

表1 大腸桿菌O157:H7樣品采集與分布

1.2 儀器與試劑生物學顯微鏡；梯度PCR儀；Ⅱ級生物安全柜等。Dynabeads anti-E.Coli O157（IMPs）和OXOID藥敏紙片，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；大腸桿菌O157顯色培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司和博賽生物技術股份有限公司；API-20E，購自法國生物梅里埃；大腸埃希菌診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司；大腸桿菌O157:H7標準菌株EK274，西北農林大學楊保偉贈。

1.3 大腸桿菌的前期增菌取樣品至BPW均質袋，37℃搖床培養4～6 h后；取1 mL培養液加入EC肉湯，37℃培養24 h。

1.4 免疫磁珠與分純按大腸桿菌O157免疫磁珠試劑盒說明書操作，取經免疫磁珠吸附的菌液在廣東環凱大腸桿菌O157顯色培養基上劃線，37℃培養24 h；挑取可疑菌落劃線于博賽科瑪嘉O157顯色培養基，37℃培養24 h。

1.5 生化鑒定按梅里埃API-20E試劑盒說明書進行可疑菌株的生化試驗。

1.6 血清型鑒定O抗原分型，利用玻片凝集試驗進行；H抗原分型，利用試管凝集試驗進行。

1.7 多重PCR鑒定按照大連寶生物TaKaRa Ex Taq?試劑盒說明書進行。多重PCR引物參照美國FDA提供的大腸桿菌O157:H7診斷引物，其中包括目的基因：stx1、stx2、+93uid A、γ-eae A、ehx A，共5段，詳見表2；PCR反應程序為：95℃預變性15 min，95℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，25個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上110 V電泳30min后觀察多重PCR結果。

表2 大腸桿菌O157：H7多重PCR引物

1.8 藥敏紙片試驗將菌株接種至MH液體培養基中，37℃搖床培養24 h。將菌液比濁為0.5麥氏單位，然后加100μL菌液于MH固體培養基上，用涂布棒涂布均勻后，貼上藥敏紙片，37℃培養24 h，觀察細菌對藥敏紙片的敏感程度，重復試驗3次，判定參照美國NCCLS標準。

2 結果

2.1 細菌培養特性經過實驗室初篩，我們從來自重慶市武隆縣某農貿市場的雞肉樣品中，分離出1株可疑的O157菌株，命名為WL05D01。WL05D01在廣州環凱大腸桿菌O157顯色培養基上生長呈紫紅色，菌落扁平透明，邊緣光滑；在博賽科瑪嘉O157顯色培養基上呈淺紅色至淺紫色，中心灰褐色的菌落，經革蘭染色，鏡檢呈革蘭陰性，兩端鈍圓，短小桿菌，大小約為0.5×1～3μm。

2.2 生化試驗及血清型鑒定WL05D01能發酵葡萄糖、鼠李糖、密二糖、山梨醇和甘露醇；吲哚試驗陽性；V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗陰性；不產生硫化氫（H2S）；O157抗原玻片凝集試驗呈陽性；H7抗原試管凝集試驗呈陽性。API-20E試劑條結果為典型大腸埃希菌。

2.3 多重PCR樣品WL05D01與陽性對照（標準菌株EK274）在584 bp、397 bp、348 bp、252 bp、166 bp處均出現了核酸條帶；與stx1、stx2、93ui?d A、eae A、ehx A基因片段大小吻合，見圖1。

圖1 WL05D 01革蘭染色鏡檢（10×100倍）

圖2 WL05D01多重PCR電泳圖譜

2.4 藥敏紙片試驗結果按照美國NCCLS標準選擇了A組（氨芐西林、頭孢噻吩、慶大霉素）、B組（阿米卡星、環丙沙星、青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮）和C組（氯霉素、四環素）中共10種抗生素進行藥敏紙片試驗，WL05D01僅對B組的青霉素出現了耐受。除此之外，WL05D01對苯唑西林、多粘菌素B、紅霉素也出現了耐受。

3 討論

大腸桿菌O157實驗室分離鑒定耗時長，目前采用免疫磁珠（IMPs）與膠體金免疫層析法（ICA）能提高大腸桿菌O157的捕獲率［2］，此次我們選用大腸桿菌O157:H7顯色培養基代替傳統SMAC平皿，以及免疫磁珠（IMPs）對大腸桿菌O157進行濃縮捕獲，從市販雞肉中分離出了1株大腸桿菌O157:H7，檢出率僅為0.54%，如果能結合膠體金免疫層析法（ICA）或許檢出率會有所提高。

由于大腸桿菌的血清型較多，其中作為食源性能感染人的大腸桿菌O157型的菌株一般都有志賀菌素，但有可能不全［3］，志賀菌素是致使感染患者出現出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合征的主要致病因子［4］。丁紅雷等［5］2006年調查結果稱，重慶市和三峽庫區從豬糞便樣品中分離的大腸桿菌O157部分菌株有stx1，所有菌株均缺失stx2；上海趙秋華等［6］從豬場分離的菌株也僅檢出出志賀菌素stx1；此次從農貿市場雞肉樣品中分離的菌株WL05D01里stx1和stx2毒力基因都存在，說明從雞肉中分離的WL05D01有可能是大腸桿菌O157高致病菌株。

根據藥敏試驗結果，此次分離的WL05D01菌株按NCCLS標準，僅對B組有選擇性報告的藥物中β-內酰胺類的青霉素耐受；另外對3種抗生素耐受，其中涉及到大環內酯類（紅霉素）的耐受，這也與柳巨雄等［7-8］研究結果相同。此次調查樣品采集的范圍涉及3個省市生豬屠宰場和零售市場，從分離結果來看生豬屠宰場未檢出大腸桿菌O157型，從生豬屠宰場、農貿市場、超市采集的各個環節的環境拭子也未能分離出大腸桿菌O157型，但從市販雞肉分離出了大腸桿菌O157:H7，證明市販雞肉潛在著被大腸桿菌O157:H7污染的風險，為避免受污染的肉品通過食物鏈進入市場造成食源性疾病的暴發，有關部門應規范家禽宰殺點屠宰檢疫。

［1］Riley，LeeW，Remis，etal.Hemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype［J］.New England Journal ofMedicine，1983，12（308）：681-685.

［2］Hui Qi，Zhen Zhong，Han-Xin Zhou，et al.A rapid and highly sensitive protocol for the detection of Escherichia coli O157:H7 based on immunochromatography assay combined with the enrich?ment technique of immunomagnetic nanoparticles［J］.International Journalof Nanomedicine，2011，6：3033-3039.

［3］A tsushi Iguchi，Hiroki Shirai，Kazuko Seto，et al.W ide Distribu?tion of O157-Antigen Biosynthesis Gene Clusters in Escherichia coli［J］.PLoSOne，2011：6（8）：e23250.

［4］Krystle L，Mohawk，Alison D.O'Brien.Mouse Models ofEsche?richia coliO157:H7 Infection and Shiga Toxin Injection［J］.J Biomed Biotechnol，2011，2011：258185.

［5］丁紅雷.重慶市及三峽庫區大腸桿菌O157的流行病學調查［D］.重慶：西南大學，2006.

［6］趙秋華，王少輝，劉萍萍，等.上海市閔行區豬場中大腸桿菌O157：H7的分離鑒定及生物學特性研究［J］.中國動物傳染病學報，2013，2l（3）：38.44.

［7］Khana，Das SC，Ramamurthy T，etal.Antibiotic resistance viru?lence gene and molecular profiles of Shiga toxin-producing Esch?erichia coli isolates from diverse sources in calcutta，india［J］.J Clin Microbiol，2002，40（6）：2009-2015.

［8］柳巨雄.動物源性大腸桿菌O157對β-內酰胺類和氨基糖苷類藥物耐藥相關機制的研究［D］.吉林：吉林大學，2005.

S852.61+2

B

0529-6005（2015）12-0052-03

2015-08-03

農業部農產品質量安全監管（風險評估）項目（GJFP201500803）

藺露（1983-），女，獸醫師，碩士，主要從事動物疫病防控、實驗室細菌學檢測，E-mail：yokokiki@foxmail.com