鵝源鴨疫里默菌的分離鑒定與藥敏試驗

胡曉苗，戴 銀，沈學懷，趙瑞宏，侯宏艷，潘孝成，周學利，張丹俊，朱傳明

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽合肥230031）

鵝源鴨疫里默菌的分離鑒定與藥敏試驗

胡曉苗，戴 銀，沈學懷，趙瑞宏，侯宏艷，潘孝成，周學利，張丹俊，朱傳明

（安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，安徽合肥230031）

鵝傳染性漿膜炎是由鴨疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起鵝的以纖維蛋白滲出并在臟器表面沉積，胸、腹腔大量積液為特征的一種接觸傳染性疾病，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪型輸卵管炎和腦膜炎。2～8周齡鵝多發，發病率90%，死亡率10%～40%，給養鵝業造成很大經濟損失。國內有關鵝傳染性漿膜炎研究比較少，胡清海［1］研究表明，2株鵝源RA分離株對雛鴨和雛鵝的致病性沒鴨源分離株強，而且對雛鵝的致病性比雛鴨強。趙寶華［2］從揚州郊區發病鵝場分離到1株對鵝具有很強致病性的鵝源RA。呂敏娜［3］分離鑒定出1株血清1型的RA，序列分析顯示，鵝源分離株與鴨源RA處于同一進化支上，與雞源RA進化關系稍遠，對鴨和鵝均有高致病性，自家疫苗能夠較好地保護雛鵝。作者對來自安徽省兩家疑似患有RA鵝群的病料，進行了細菌分離、生化試驗和PCR方法鑒定，分離鑒定出2例鵝源RA，為該病的診斷和防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源選擇兩家鵝場具有典型纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎以及腸炎的病死鵝，無菌操作采集患病鵝的肝臟與腦組織。

1.2 細菌分離培養無菌環境下操作，取病死鵝的肝臟和腦接種在胰酶大豆瓊脂培養基（TSA培養基）上，在37℃二氧化碳恒溫箱中培養36 h。若未培養出疑似菌落則重新取樣分離，若存在則挑選平板上數個圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀的菌落平板劃線法在LB培養基上傳代，于37℃CO2恒溫箱中培養36 h～48 h以獲得純培養。

1.3 革蘭染色取之前純培養的菌做菌液，經涂片固定，做革蘭染色。

1.4 生化試驗鑒定挑取2組新鮮菌液按常規方法分別進行明膠液化試驗、過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗、糖發酵試驗。

1.5 PCR方法的鑒定

1.5.1 PCR擴增根據GenBank中發表的鴨疫里默菌（RA）1-19型16S rRNA基因序列分別與大腸埃希菌等的16S rRNA基因序列比對設計特異性引物［4］：F：5′-CTGAACACGGTGTACGAATAAG-3′；R：5′-TCTTATACGAGTCCCCAAC-3′，片段大小680 bp。采用20μL體系：RA 16s rRNA F：0.5μL，RA 16 s rRNA R：0.5μL，DNA模板1μL（新鮮菌液），Premix Taq DNA聚合酶10μL，ddH2O補足20μL。PCR反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30 s，58℃復性45 s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃溫育8 min。凝膠電泳檢測，取20μL PCR產物混合2μL 10 Loading Buffer在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，另加5μL DL-2 000 DNA Marker作為標準，結果在凝膠成像系統中觀察。

1.5.2 PCR產物的純化與克隆PCR產物純化及與質粒pMD18-T的連接分別參照試劑盒的說明書進行，連接后轉化E.coli DH5α、篩選陽性克隆［5］。

1.5.3 重組質粒的鑒定將根據藍白斑篩選原則篩選的陽性克隆接種于5 mL的LB液體培養基（含氨芐青霉素）中振蕩培養后，取2 mL重組菌液，用SanPrep柱式質粒DNA小量抽取試劑盒抽提質粒，PCR后拍照鑒定，取經鑒定的重組菌液1 mL送上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。

1.6 藥敏試驗按常規藥敏紙片法測定2株分離菌株對頭孢噻肟、丁胺卡那霉素等18種抗生素的敏感性。敏感度根據杭州天和微生物試劑有限公司提供的標準進行判定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養獲得純培養菌落較小，呈圓形、透明、邊緣光滑、奶油狀，取純培養菌做菌液，經涂片固定，做革蘭染色，在油鏡下觀察到紅色陰性小桿菌，單個或成對，少數呈絲狀，無芽孢。

2.2 生化試驗鑒定兩株分離菌株不發酵糖類和醇類，不產生硫化氫，尿素酶和過氧化氫酶試驗陽性（見表1）。因此，根據其形態學特征、培養和生化特性可初步確定為RA。

2.3 病鵝腦部分離菌株16s rRNA PCR擴增結果病鵝腦部兩株分離菌株以16s rRNA設計引物時PCR擴增得都1條680 bp的特異性條帶（見圖

1），與預期結果相符。

表1 鴨疫里默菌分離菌株生化試驗結果

2.4 目的基因克隆及重組質粒鑒定經鑒定陽性的菌株進行增菌培養，用SanPrep柱式質粒DNA小量抽取試劑盒抽取質粒DNA，經PCR鑒定，電泳檢測，結果與預期一致（見圖2）。

圖1 PCR檢測結果

2.5 序列測定及分析2株RA重組質粒樣品測序后經BLAST進行序列分析，測序結果與Gen?Bank中收錄的鴨疫里默菌基因序列進行比對，進一步證實為鴨疫里默菌序列。

圖2 重組質粒PCR鑒定結果

2.6 藥敏試驗結果兩株細菌（AH1、AH2）藥敏試驗結果為，AH1對頭孢噻肟鈉、硫酸丁胺卡那霉素高敏；對阿奇霉素中敏；AH2對強力霉素、壯觀霉素高敏；對左氧氟沙星、新霉素中敏；而兩株對氟苯尼考、慶大霉素、氨芐西林、潔霉素、鏈霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、磷霉素、環丙沙星、羅美沙星、利福平等藥物均不敏感。

3 討論

3.1 對RA感染進行準確診斷必需依靠細菌的分離和鑒定。鑒定RA通常檢測其培養特性、染色反應、生理生化特征、菌體的某些化學組成等表型指標，但RA常缺乏特定的表型特征和選擇性的培養基［6］，僅依據表型卻不足以對RA做出準確鑒定。因此，使用分子方法進行鑒定十分必要。本試驗通過細菌分離、生理生化鑒定、16S rRNA分析，將生理生化特性測定與16S rRNA序列分析鑒定相結合，使鑒定結果更科學、更準確。

3.2 由于細菌的16S rRNA基因分子結構上的高度保守性，因此常用于對細菌的種屬鑒定［7-9］。本試驗通過對2株鵝源RA安徽流行株的16S rRNA基因擴增和序列分析，鑒定其是否屬于鴨疫里默氏菌，所得到的序列通過比對，結果發現其與GenBank上發布的RA的16S rRNA的同源性達到99.98%。

3.3 藥物敏感性試驗中，2株鵝源里默菌對相同藥物的敏感性不盡相同，與其他報道也不盡相同［10］，說明不同鴨群RA的分離株對同種藥物表現出差異，藥敏試驗對臨床用藥治療RA感染具有重要的意義。目前由于濫用抗菌類藥物而導致耐藥性日益嚴重，因此鵝場感染RA后，最好根據RA的藥敏試驗來進行治療，避免因藥物耐藥性而造成更大的經濟損失。

［1］胡清海，劉曉文，苗晉鋒，等.一株鵝源鴨疫里氏桿菌與鴨源分離株的致病性比較［J］.畜牧與獸醫，2002，34（9）：3-4.

［2］趙寶華，徐步，范建華.鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離和鑒定［J］.中國畜牧獸醫，2010，37（8）：189-192.

［3］呂敏娜，戚南山，覃宗華，等.鵝源鴨疫里默氏桿菌的分離、鑒定與生物學特性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫，2012，39（12）：1755-1761.

［4］馮金牛，阮二壘，楊麗云，等.鴨疫里默氏桿菌的分離與16S rRNA的鑒定［J］.動物醫學進展，2010，31（6）：73-76.

［5］J薩姆布魯克，DW拉塞爾.分子克隆實驗指南［M］.3版.黃培堂譯.北京:科學出版社，2005：1130-1132.

［6］Tsai H J，Liu Y，Tseng C S，et al.Genet ic variation of the ompA and 16S rRNA genes of Riemerella anatipestifer［J］.Avian Patholo?gy，2005，34（1）：55-64.

［7］謝永福，陳芳艷，馮金牛，等.鴨疫里默氏桿菌巢式PCR檢測方法的建立［J］.中國家禽，2013，35（9）：19-22.

［8］李春芬，李郁，魏建忠，等.安徽省部分地區鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究［J］.中國預防獸醫學報，2009，31（3）：197-200.

［9］曲豐發，蔡暢，鄭獻進，等.利用16S rDNA建立種特異性PCR快速檢測鴨疫里默氏菌［J］.微生物學報，2006，46（1）：13-17.

［10］吳華，李勝利，侯百枝，等.鴨疫里氏桿菌病藥物防治研究進展［J］.動物醫學進展，2007，28（4）：96-100.

S852.612

B

0529-6005（2015）12-0048-02

2015-02-12

國家現代農業產業技術體系項目（CARS-41）；安徽省農業科學院科技創新團隊項目（11C0404）；國家自然科學基金項目（31302044）

胡曉苗（1971-），男，助理研究員，碩士，主要從事獸醫微生物與免疫學研究，E-mail：huxiaomiao66@163.com

戴銀，E-mail：daiyin2020@163.com