N lrp9b在小鼠不同組織中的表達和定位

劉 芳，江 寧，肖 瓊，孫惠文，彭 輝，張文昌

（福建農林大學動物科學學院，福建福州350002）

N lrp9b在小鼠不同組織中的表達和定位

劉 芳，江 寧，肖 瓊，孫惠文，彭 輝，張文昌

（福建農林大學動物科學學院，福建福州350002）

利用RT-PCR、免疫印跡和免疫組化方法研究Nlrp9b基因在小鼠不同組織中的表達和定位。結果Nlrp9b的轉錄物和蛋白只在小鼠的卵巢和小腸中表達；在卵巢中，NLRP9B蛋白主要在卵母細胞中定位；在小腸中，該蛋白主要定位在小腸的上皮細胞。表明Nlrp9b轉錄物和蛋白在小鼠中的表達和定位預示著該基因可能在小鼠的生殖系統和免疫系統中發揮一定的生理功能。

Nlrp9b；表達；定位；小鼠

Nlrp（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing pro?teins）基因家族分別在生殖系統和免疫系統發揮重要功能［1-3］。目前研究證實，靈長類上Nlrp1、Nlrp3、Nlrp6、Nlrp10和Nlrp12均為免疫相關基因，而Nlrp2、Nlrp4、Nlrp5、Nlrp7、Nlrp8、Nlrp9、Nlrp11、Nlrp13、Nlrp14這些基因均為生殖相關基因［4］。在小鼠上Nlrp7、Nlrp8、Nlrp11和Nlrp13可能在進化的過程中丟失而未被發現［4］。由于小鼠Nlrp基因家族存在譜系特異性復制，所以存在Nlrp9a、Nlrp9b和Nlrp9c這3個基因，有研究發現Nlrp9a和Nlrp9c只在小鼠卵母細胞中表達，但是對小鼠早期胚胎發育并沒有影響［5］，所以我們推測Nlrp9b基因可能在小鼠胚胎發育過程中起到關鍵性的作用。本試驗旨在確定Nlrp9b基因的表達和定位，為進一步探討Nlrp9b基因的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物試驗ICR雌鼠來源于福建醫科大學實驗動物中心，飼養在光照周期為14/10 h（白天/黑夜）的室內，溫度控制在25℃±1℃，相對濕度在50%～60%。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成將試驗小鼠飼養至4周齡處死，并迅速取下不同組織，包括卵巢、小腸、睪丸、肺、心臟、肝、腦、胃、脾臟和肌肉，并分別置于液氮中研磨，在每個研磨后的樣品中各取50～100 mg，分別放入1.5 m L的離心管中，在冰盒上向離心管中加入1mL TRIZol試劑進行抽提組織RNA，測量提取出來的RNA的OD值并記錄RNA濃度。采用PrimeScript II 1st Strand cD?NA Synthesis Kit合成組織cDNA。

1.3 RT-PCR所用引物如表1，先利用普通RTPCR確定最佳退火溫度，并確定擴增產物的長度且沒有非特異性擴增。

PCR反應體系為25μL體系，其中的混合液如表2所示。

表1 基因特異性引物序列

表2 PCR反應體系

將反應體系輕輕搖勻并瞬離，在PCR儀中進行cDNA擴增，PCR的反應參數為：95℃預變性1 min，94℃30 s，57℃/60℃30 s，72℃25 s，擴增35個循環。反應結束后取出PCR反應產物用濃度2%（m/v）瓊脂糖凝膠電泳，之后取出膠在凝膠成像儀下照相并分析。

1.4 Western Blot取雌鼠的等量的不同組織，包括卵巢、小腸、睪丸、肺、心臟、肝、腦、胃、脾臟和肌肉，分別在組織裂解液中裂解，將研磨混合液吸出放入1.5 mL離心管中，10 000～14 000 r/min（4℃）離心10min，取上清液。之后加入適量蛋白上樣緩沖液，100℃煮10min。用8%SDS-PAGE電泳將其蛋白分離，每個泳道加入等量蛋白樣品。利用濕轉方法將蛋白轉到NC膜上，使用含5%脫脂奶粉的TBS在室溫下封閉4 h，之后將NC膜置入1∶1 000稀釋的一抗溶液中4℃孵育過夜。然后TBS洗滌膜3次，每次10 min，置于辣根過氧化物酶標記的1∶1 000稀釋的二抗中孵育2 h，用TBS洗滌3次，每次10min。用增強型化學發光的蛋白質印跡檢測試劑盒檢測NLRP9B蛋白并在暗室曝光。β-actin的檢測方法同上并作為對照。

1.5 免疫組化取6周齡小鼠的卵巢和小腸用4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，切片約6μm厚度。這些切片經過二甲苯中脫蠟、梯度酒精再水化后，置入10mmol/L枸櫞酸鈉中在微波爐中進行抗原修復（中火，15 min），之后自然冷卻到室溫。免疫組化染色方法是鏈霉素-生物素法（SP法），首先將切片用10%非免疫羊血清封閉，然后用NLRP9B抗體在4℃過夜孵育（1∶200稀釋）。經過多次沖洗之后，加入生物素化的羊抗兔二抗，室溫孵育10min，之后再用抗生蛋白鏈菌素鏈接的堿性磷酸酶和BICP/NBT底物檢測目的蛋白。對照試驗中除了不加一抗，其他所有操作步驟與正常試驗相同。將切片分別用封片液封片，再用顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 Nlrp9b轉錄物和蛋白在小鼠不同組織中的表達為了研究Nlrp9b轉錄物和蛋白在小鼠10種不同組織中的表達情況，我們分別進行了RTPCR和免疫印跡（WB）分析。結果如圖1所示，RT-PCR的分析表明，Nlrp9b的轉錄物只在小鼠的卵巢和小腸中檢測到，在其他的組織中檢測不到Nlrp9b的表達。同樣，免疫印跡的試驗結果與RT-PCR的分析結果一致（圖2）。

圖1 N lrp9b基因在小鼠10種不同組織中的表達水平M：Marker對照；OV：卵巢；In：小腸；Te：睪丸；Lu：肺；He：心；Li：肝；Br：腦；St：胃；Sp：脾臟；Mu：肌肉；Hprt1為內參

圖2 NLRP9B蛋白在小鼠10種不同組織中的表達水平

2.2 NLRP9B蛋白在小鼠卵巢和小腸中的定位

Nlrp9b基因只在小鼠的卵巢和小腸中表達，為了研究NLRP9B蛋白在這兩種組織中的定位，我們進行了免疫組織化學分析。結果表明，在卵巢中，NLRP9B蛋白在不同時期卵泡的卵母細胞中定位。在小腸中，NLRP9B蛋白在小腸黏膜上皮細胞中存在（見中插彩版圖3）。

3 討論

本試驗通過RT-PCR和免疫印跡方法發現，Nlrp9b轉錄物和蛋白均在小鼠卵巢和小腸中表達，并且利用免疫組化證實這一結果。Nlrp基因家族主要在生殖系統和免疫系統中起重要作用。研究表明，Nlrp2和Nlrp5只在卵巢組織中表達［6-9］，Nlrp8、Nlrp9和Nlrp14在卵巢和睪丸中均有表達［7、10］，說明這些基因均與動物的生殖相關。本試驗結果顯示，Nlrp9b基因也在卵巢中表達，并且只存在于卵母細胞，由此我們推測Nlrp9b基因有可能參與小鼠的早期胚胎發育。為了證實該推斷，后期我們會進一步研究Nlrp9b基因的具體功能。

本研究發現Nlrp9b基因不僅在小鼠卵巢中表達，還在小腸中檢測到該基因的轉錄物。彭輝等［5］研究Nlrp9a和Nlrp9c基因時發現這些基因只在卵巢組織中表達，這說明Nlrp9b基因的表達模式與Nlrp9a和Nlrp9c的不同。有研究發現，Nlrp12基因也在小腸中表達，小鼠缺失該基因會表現出明顯的炎癥反應［11-12］，說明該基因參與了免疫應答反應，所以我們推測Nlrp9b基因不僅在生殖系統中起一定作用，還可能在小腸發生或腸黏膜免疫方面發揮功能。免疫組化的結果顯示，Nlrp9b蛋白定位在小腸黏膜上皮細胞，吳翰桂等［13］研究表明，小腸粘膜由于含有上皮淋巴細胞而具有免疫功能，這進一步說明Nlrp9b基因可能參與了小腸的黏膜免疫。彭輝等［14］對免疫相關基因Nlrp1a、Nlrp1b、Nlrp1c、Nlrp3、Nlrp6、Nlrp10和Nlrp12做了充分的研究，結果表明，這些免疫相關基因的表達位置不盡相同，說明這些基因的功能存在差異。因此，Nlrp9b基因的功能也可能與其他的免疫相關基因不同。

4 結論

Nlrp9b基因分別在小鼠的卵巢和小腸表達，預示著該基因可能在生殖系統和免疫系統中發揮一定的生理功能。

［1］常博皞.Nlrp4e在小鼠附植前胚胎發育中的表達，定位及功能［D］.楊凌：西北農林科技大學，2012.

［2］Zhang P，Dixon M，Zucchelli M，et al.Expression analysis of the NLRpgene family suggests a role in human preimplantation de?velopment［J］.PLoSOne，2008，3（7）：e2755.

［3］Vandanmagsar B，Youm Y H，Ravussin A，et al.The NLRP3 in?flammasome instigates obesity-induced inflammation and insulin resistance［J］.Nat Med，2011，17（2）：179-188.

［4］Tian X，Pascal G，Monget P.Evolution and functional divergence of NLRpgenes inmammalian reproductive systems［J］.BMC evolu?tionary biology，2009，9（1）：202.

［5］Hui Peng，Wengchang Zhang，Tianfang Xiao，et al.Expression patterns of Nlrp9a，Nlrp9b and Nlrp9c duringmouse development［J］.Biologia：Casopis Slovenskej Akademie Vied，2014，69（1）.

［6］Wu X.Maternal depletion of NLRP5 blocks early embryogenesis in rhesus macaque monkeys（Macaca mulatta）［J］.Human repro?duction，2009，24（2）：415-424.

［7］Ponsuksili S，Brunner R M，Goldammer T，et al.Bovine NALP5，NALP8，and NALP9 genes：assignment to a QTL region and the expression in adult tissues，oocytes，and preimplantation embryos［J］.Biology of reproduction，2006，74（3）：577-584.

［8］Laura Francesca Pisani，Paola Ramelli，et al.Characterization of maternal antigen that embryos require（MATER/NLRP5）gene and protein in pig somatic tissues and germ cells［J］.Journal of repeoduction and development，2010，56（1）：41-48.

［9］彭輝.Nlrp基因家族的表達及Nlrp2和Nlrp4g在小鼠早期胚胎發育過程中的功能［D］.楊凌：西北農林科技大學，2012.

［10］Westerveld G H，Korver CM，van Pelt A M M，etal.Mutations in the testis-specific NALP14 gene inmen suffering from spermatogenic failure［J］.Human Reproduction，2006，21（12）：3178-3184.

［11］劉云福.NLRP12基因SNP及表達對家兔非特異性消化道紊亂的影響［D］.雅安：四川農業大學，2013.

［12］Zaki M H，pVogel，R Malireddi，et al.The NOD-like receptor NLRP12 attenuates colon inflammtion and tumorigensis［J］.Cancer Cell，2011，20（5）：649-660

［13］吳翰桂，朱誠，丁仁瑞，等.腸道粘膜免疫研究進展［J］.免疫學雜志，2000，16（3）：235-237.

［14］彭輝，張文昌，肖天放，等.Nlrp基因家族部分免疫相關基因在小鼠上的表達［J］.福建農業大學學報（自然科學版），2013，42（4）：398-402.

Expression and Localization of Nlrp9b gene inmouse different tissues

LIU Fang，JIANGNing，XIAOQiong，SUN Hui-wen，PENGHui，ZHANGWen-chang
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China）

The expression and localization of Nlrp9b gene in different tissues ofmouse was investigated by RT-PCR，western blotand immunohistochemistry analysis.The results indicated that the expression of Nlrp9b transcripts and protein was detected in ovary and intestines.Nlrp9b protein was located in oocytes of different follicles in the ovary and in epithelial cells of small intes?tine.In conclusion，the expression and localization of Nlrp9b gene suggest that this gene plays a role in reproductive system and im?mune system in themouse.

Nlrp9b；expression；localization；mouse

ZHANGWen-chang

S865.1+3

A

0529-6005（2015）12-0030-03

2015-07-21

國家自然科學基金青年基金（31402079）；福建省自然科學基金（2014J01071）

劉芳（1989-），女，碩士生，研究方向為動物生殖生理與胚胎工程，E-mail：1071051602@qq.com

張文昌，E-mail：zwcfz@163.com