豬圓環病毒2型重組腺病毒核酸擴增檢測標準樣品的研制

高志強，劉 環，林祥超，張 偉，喬彩霞，谷 強，蒲 靜，張鶴曉

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026；2.青島農業大學動物科技學院，山東青島266109）

豬圓環病毒2型重組腺病毒核酸擴增檢測標準樣品的研制

高志強1，劉 環1，林祥超2，張 偉1，喬彩霞1，谷 強1，蒲 靜1，張鶴曉1

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026；2.青島農業大學動物科技學院，山東青島266109）

為研制用于豬圓環病毒2型（PCV-2）核酸擴增檢測（NAT）質量控制的標準樣品，本研究將豬圓環病毒2型QD/2014株ORF2連接到缺陷型腺病毒穿梭質粒pacAd5 CMV K-NpA上，構建了重組穿梭質粒CMV-PCV-2-ORF2。將其與骨架質粒pacAd5 9.2-100線性化后共轉染HEK293T細胞，經胞內重組獲得了內含PCV-2-ORF2的重組腺病毒pacAd5 CMV-ORF2。采用PCR和基因測序方法對重組病毒鑒定后進行大量培養、分裝和凍干，經均勻性和穩定性檢驗后對其進行了定值。結果表明，制備的標準樣品均勻、穩定，PCV-2-ORF2基因含量為8.17×109GEq/mL，在HEK293細胞上的TCID50為3.56×107/0.05mL。本標準樣品的研制成功為核酸檢測標準物質制備開辟了一條新途徑。

豬圓環病毒2型；ORF2；重組腺病毒；標準樣品

豬圓環病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）呈世界性分布，在家豬和野豬體內均有發現。目前認為PCV-2是一種重要的豬病病原，可引起豬的多種疾病，稱為PCV-2相關性疾病（PCV-2-associated diseases，PCVAD）。PCV-2感染可造成豬群免疫力下降，可導致多種疫苗免疫失敗，并導致豬只死亡率增加，因此對養豬業影響巨大［1］。

PCV-2基因組包括2個主要的ORF，其中ORF2不僅是其主要結構蛋白基因，也是核酸擴增檢測的靶區域［2］。PCV-2感染的確診通常需要采用實驗室檢驗方法進行，一般需檢出病毒或其組分。由于核酸擴增檢測方法（NAT）的特異和高效，目前已經成為PCV-2快速檢測的首選方法并得到廣泛應用，但采用NAT方法一般均需使用標準質控品或標準樣品來確保結果的準確性。高質量的標準品應具有無生物安全風險，與被檢樣品狀態相近，可全程質控、具有量值范圍和一定精密度的特性［3-4］。由于病原的繁殖涉及生物安全問題，近年來，核酸標準物質越來越受到國際認可。目前動物疫病檢測核酸標準物質主要有病原基因組核酸標準物質和具有檢測意義的核酸片段標準物質，但制備這些標準物質的最大難點是準確定量問題。因此，探索能夠容易定量的核酸檢測標準物質成為熱點。由于PCV-2在細胞上不導致病變，測定不致細胞病變的病毒TCID50較繁瑣且受人為因素影響較大，將不致細胞病變病毒的具有檢測意義的核酸片段重組到對人和動物無危害的病毒載體，重組病毒能夠對特定細胞產生致細胞病變作用，這樣對重組病毒的滴度測定可反映插入核酸片段的量。本研究首次以缺陷型人5型腺病毒為載體，將PCV-2 NAT檢測靶區域ORF2重組到病毒中，獲得重組腺病毒，在測得TCID50和其基因含量后，經檢驗和定值后，作為標準樣品應用于檢測質量控制，取得滿意效果。

1 材料與方法

1.2 豬圓環病毒2型ORF2基因的擴增克隆以提取的PCV-2基因組DNA為模板，設計1對引物（序列見表1）經PCR擴增PCV-2-ORF2基因。反應條件為94℃預變性5min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。將PCR產物純化后克隆于pMD19-T，并進行鑒定。

1.3 重組腺病毒穿梭載體的構建使用Kpn I和Hind III對重組質粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭載體pacAd5 CMV K-NpA雙酶切后，經連接轉化構建CMV-PCV-2-ORF2重組穿梭質粒，并進行鑒定。1.4重組腺病毒在細胞HEK293T中的包裝與增殖

應用Pac I對質粒CMV-PCV-2-ORF2與pacAd5 9.2-100線性化，純化后共轉染HEK293T細胞。同時，對質粒CMV-GFP與pacAd5 9.2-100進行相同操作，作為轉染對照；正常的HEK293T作為細胞對照。當轉染細胞出現70%以上CPE，且轉染對照GFP出現大量熒光時，收集各組細胞。反復凍融3次后，于HEK293細胞中進行連續傳代，對第7代重組腺病毒進行鑒定。

1.5 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒的鑒定

將第7代pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2接毒細胞、轉染對照pacAd5 CMV-GFP接毒細胞以及正常HEK293細胞，離心取細胞沉淀后分別提取DNA和RNA。對于提取的RNA，利用DNAse I消化其中可能殘留的DNA。使用表1擴增引物分別進行PCR和RT-PCR鑒定，RT反應條件為42℃60min，70℃15min，其他反應條件同1.2。對擴增產物進行測序鑒定。

1.6 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒凍干將大量培養的第7代pacAd5 CMV-ORF2接毒細胞反復凍融3次后，去除細胞碎片，按照1%加入海藻糖作為凍干保護劑，無菌條件下按照0.5mL/瓶分裝于西林瓶中，真空狀態下冷凍干燥24 h。

1.7 均勻性和穩定性檢驗抽取10管凍干品，提取DNA并作103倍稀釋。應用PCV-2熒光PCR方法在一次試驗中測試10份DNA樣品，每個樣品設3個重復。采用最大二階導數法獲取Ct值；另對10管凍干品測定其TCID50，每個測2次。對獲得數據用單因子方差分析進行統計處理。

在以下每種條件下放置6瓶：（1）室溫20℃～25℃；（2）冷藏溫度2℃～8℃；（3）-20℃。定期取樣提取DNA作103倍稀釋后保存于-80℃。3個月后，應用PCV-2熒光PCR方法在一次試驗中進行測試，采用最大二階導數法獲取Ct值；另測定凍干品的TCID50。對結果采用成對雙樣本均數-t檢驗進行統計分析。

PRB安裝在地下含水層當中，與地下水流方向垂直，以保證污染羽與反應介質能充分反應，當污染地下水流經PRB時，其中的污染物濃度能夠被降低.目前常見的PRB結構類型有三種：連續墻式結構、漏斗-導水門式結構和灌注處理帶式結構[22].其他結構如墻簾式PRB[23]、微生物反應墻[24]、虹吸式PRB[25]等都是在上述三種結構的基礎上優化改進而來.

1.8 重組腺病毒的初步定值（GEq/mL和TCID50測定）

將純化的質粒pMD19-T-ORF2，通過測定其260 nm的吸光度值，并推算拷貝數，系列稀釋后制成外標品，應用熒光PCR方法間接測定標準品的拷貝數。另外，取凍干品還原后，分別作10倍梯度稀釋（101～1012）測定其TCID50。

2 結果

2.1 PCV-2-ORF2基因PCR擴增結果以提取的PCV-2基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得大小為702 bp的目的片段（見圖1），與預期結果相符。

表1 基因克隆及熒光PCR引物探針

圖1 ORF2基因擴增結果

2.2 重組腺病毒穿梭載體的構建重組穿梭質粒CMV-PCV-2-ORF2經Hind III和Kpn I雙酶切后，得到大小為702 bp的目的片段，測序結果與已知序列一致。

2.3 重組腺病毒在細胞HEK293T中的包裝與增殖重組穿梭質粒與骨架質粒共轉染24 h后，對照轉染組可見少量熒光，10 d達峰；pacAd5 CMVORF2共轉染5 d后，細胞發生明顯細胞病變（CPE）；而正常HEK293T細胞不出現CPE（見中插彩版圖2）。

2.4 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒的鑒定結果結果顯示，只有pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2感染細胞提取的DNA和RNA經（RT-）PCR擴增均有約702 bp的擴增條帶，擴增產物測序結果與預期一致。

2.5 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒凍干以1%海藻糖作為凍干保護劑，真空狀態下冷凍干燥24 h得到了凍干品。

2.6 均勻性和穩定性檢驗結果凍干品的均勻性檢驗結果經單因子方差分析，結果顯示對于Ct值，F（20，9）=2.21，＜F0.05（2.39）；對于TCID50，值，F（10，9）= 1.75，＜F0.05（3.02）對于表明凍干品中被檢物是均勻的。

穩定性檢驗數據經成對雙樣本均數-t檢驗進行統計分析顯示，對于Ct值數據，t值分別為1.59和0.87；對于TCID50數據，t值分別為0.55和0.59。均＜t0.05（2.13）表明凍干后樣品穩定性良好；Ct值和TCID50變化情況見圖3。

圖3 不同保存條件下穩定性結果

2.7 重組腺病毒的初步定值結果（GEq/mL和TCID50測定結果）采用熒光定量PCR檢測，經線性回歸，獲得標準樣品候選物PCV-2-ORF2基因含量為8.17×109GEq/mL。在HEK293細胞上的TCID50經測定為3.56×107/0.05mL。

3 討論

目前，PCV-2是危害養豬業的一種重要病原，據報道PCV-2感染可導致豬場豬只死亡率的增加從2%～3%到14%～30%不等［1］。因此，使用快速、靈敏的PCV-2病毒檢測方法用于養豬場疫情監測非常重要。基于NAT檢測方法的特異、高效，目前已報道了很多基于NAT的PCV-2快速檢測方法［5-6］。NAT檢測方法屬于相對復雜的生物測定方法，對于同樣的樣品，由于DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引物、探針的效率不同都會給檢測結果帶來差異，甚至出現不同的結果，進而影響結果的判定。

為保證檢測質量，評估不同NAT檢測方法效力和實驗室檢驗能力，研制均勻、穩定，可進行量值傳遞的標準樣品用于PCV-2的檢測質控非常必要。目前用于PCV-2 NAT檢測的質控品為滅活病毒和質粒DNA制備，或制備復雜需要生物安全設施，或雖制備簡單，但不能質控DNA提取過程，而且易造成氣溶膠污染。均存在明顯不足之處，不能滿足實際需求。由于PCV-1和PCV-2基因序列最大的差異也位于ORF2基因內，故目前檢測PCV-2的NAT方法均以ORF2作為靶標進行設計［2］。腺病毒無囊膜，與PCV-2結構大體類似，而且背景清楚，使用安全方便，因此本研究經一系列試驗制備了PCV-2重組腺病毒核酸擴增檢測標準樣品。

在腺病毒轉染與擴繁過程中發現，HEK293T的轉染效率高于HEK293，但HEK293T細胞用于繁殖病毒效價很低。故而在試驗中先使用HEK293T細胞進行轉染，轉染成功后再使用HEK293細胞進行病毒擴繁，取得滿意效果。均勻性和穩定性試驗表明PCV-2重組腺病毒經分裝凍干后，目標成分均勻、穩定。但標準樣品的GEq/mL和TCID50的精確量值還需進一步的協作標定研究［3］。

綜上所述，本研究研制的PCV-2重組腺病毒標準樣品符合臨床生物類標準樣品的基本要求-均勻、穩定，與被測物品狀態相近且具有量值，可用于PCV-2 NAT測試中DNA提取、擴增等全過程的質量控制，而且重組后的病毒能夠對特定細胞出現致細胞病變作用，也可以通過對重組病毒的滴度測定間接了解插入的核酸片段的量。本核酸檢測標準物質推廣應用后可促進PCV-2 NAT檢測方法的規范化和標準化。

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［3］World Health Organization.Recommendations for the preparation，characterization and establishment of international and other bio?logical reference standards［M］.WHO Technical Report Series No：932，2006：25-36.

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Establishment of Recombinant Adenovirus as Referencematerial for Porcine Circovirus Type 2 Nucleic Acid Am plification Technology（NAT）-based Assays

GAO Zhi-qiang1，LIU Huan1，LIN Xiang-chao2，ZHANGWei1，QIAOCai-xia1，GUQiang1，PU Jing1，ZHANGHe-xiao1
（1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China；2.Animal scienceand Technology college，Qingdao Agricultural Vuiversity，Qingdao 266109，China）

Recombinant adenovirus containing PCV-2 ORF2 gene，whichmimics naturally DNA virus particles，can be used as candidate reference material for nucleic acid amplification technology（NAT）-based assays of PCV-2.In this paper，the com?plete ORF2 of PCV-2 stain QD/2014 was amplified and cloned to defective adenovirusshuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA to construct recombinant shuttle plasmid CMV-ORF2.When the linearized CMV-PCV2-ORF2 and backbone plasmid pacAd5 9.2-100 by Pac Iwere co-transfected into HEK293T cells，the adenovirus pacAd5 PCV-2 containing ORF2 were obtained by recombi?nation in vivo.Then the recombinant viruswhich was stable in propagation was verified by PCR and Sequencing.After propagation，aliquot，lyophilization，homogeneity and stability testing，the GEq/m l（gene equivalents/mL）and TCID50of the recombinant virus were determined.The result showed the prepared candidate referencematerial was homogeneous and stable with a value of 8.17× 109GEq/mL and 3.56×107/0.05mL（TCID50）.Based on the establishment of the PCV-2 candidate referencematerial，a new way for preparation of referencematerials for NAT-based assaywas developed.

Porcine circovirus type 2；ORF2；Recombinantadenovirus；Referencematerial

ZHANGHe-xiao

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0010-03

2015-08-26

質檢公益性行業科研專項“動物疫病核酸標準物質制備關鍵技術研究”（201310253）

高志強（1974-），男，研究員，博士，主要從事動物檢驗檢疫研究，E-mail：gaozhiqiang02@163.com

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com