宮頸癌及CINⅢ組織miRNA-34a表達及意義

袁匯，趙淑萍，戴紅英

(青島大學醫學院附屬醫院婦科,山東 青島 266003)

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宮頸癌及CINⅢ組織miRNA-34a表達及意義

袁匯，趙淑萍，戴紅英

(青島大學醫學院附屬醫院婦科,山東 青島 266003)

目的 探討miRNA-34a(miR-34a)在宮頸上皮內瘤變(CINⅢ)及宮頸鱗癌組織和血清表達及其意義。方法 選擇41例宮頸鱗癌病人(宮頸癌組)、27例CINⅢ病人(CINⅢ組)和20例正常宮頸者(對照組)，提取其血清及組織中的小分子RNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測miR-34a的表達。結果 宮頸癌及CINⅢ組織中miR-34a相對表達水平明顯低于對照組，差異有顯著性(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)。宮頸癌組血清中miR-34a相對表達量較CINⅢ組明顯下降，差異有顯著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ組血清中miR-34a相對表達量較對照組也明顯下降，差異有顯著性(q=7.08，P<0.01)。宮頸癌組病人血清及組織中miR-34a的表達呈正相關(r=0.886，P<0.01)。結論 miR-34a在CINⅢ及宮頸鱗癌病人組織及血清中異常表達，可能在宮頸癌的發生和發展過程中發揮重要作用，對宮頸癌的診斷具有一定臨床價值。

miRNA-34a；宮頸上皮內瘤樣病變；宮頸腫瘤；聚合酶鏈反應

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤。近年來,宮頸癌的發病率逐年升高，發病日趨年輕化，嚴重威脅婦女健康和生命。研究顯示，大量增高或降低的微小RNA(miRNA)在宮頸癌的發生發展中發揮著重要的作用[1]。已有研究表明，miRNA-34a(miR-34a)異常表達與多種腫瘤發生與發展相關，如非小細胞肺癌[2]、膀胱癌[3]、前列腺癌等[4]。本文旨在檢測miR-34a在宮頸上皮內瘤變(CINⅢ)及宮頸鱗癌組織中的表達，探討其在宮頸鱗癌發生、發展中可能的作用及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2013年1月—2014年4月，青島大學附屬海慈醫院婦科住院宮頸鱗癌手術病人癌組織標本41例(宮頸癌組)，術前均未行放、化療。病人年齡31～62歲，平均44.5歲。病理分級:G1級7例，G2級10例，G3級24例。按國際婦產科聯盟(FIGO)的分期標準，Ⅰ期21例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期5例。CINⅢ病人的組織標本27例(CINⅢ組)，病人年齡28～51歲，平均39.3歲。另取同期年齡匹配的正常宮頸組織標本20例作為對照。所有標本均經有經驗的病理醫師明確診斷。清晨空腹時分別采集各組病人靜脈血5 mL于真空干燥管中，以1 500 r/min離心15 min，吸取上層血清于潔凈離心管中，然后置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.2 研究方法

按照miRcute miRNA提取分離試劑盒使用說明書的步驟從組織及血清中提取總RNA。Beckman DU 800型紫外線分光光度計測定RNA提取液A260吸光度值，計算總RNA濃度。逆轉錄參照逆轉錄試劑盒說明書進行，首先對提取的總RNA進行逆轉錄，然后按照熒光定量PCR試劑盒操作說明操作,反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，60 ℃15 s，進行40個循環。以U6為內參照，以去RNA酶的水模板為陰性對照，得到各模板的Ct值，然后用公式2-△△Ct計算各樣本中miR-34a的相對表達量。每個樣品重復實驗3次，取均值。

2 結 果

對照組、CINⅢ組和宮頸癌組組織中miR-34a的相對表達水平分別為0.908±0.223、0.528±0.299、0.211±0.208，血清中miR-34a的相對表達水平分別為0.960±0.212、0.584±0.288、0.341±0.250。宮頸癌及CINⅢ組織中miR-34a相對表達水平明顯低于對照組，差異有顯著意義(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)；宮頸癌組和CINⅢ組組織中miR-34a相對表達水平差異也有顯著性(q=8.30，P<0.01)。宮頸癌組血清中miR-34a相對表達量較CINⅢ組明顯下降，差異有顯著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ組血清中miR-34a相對表達量較對照組明顯下降，差異有顯著性(q=7.08，P<0.01)。見表1。宮頸癌病人血清與組織中miR-34a表達呈正相關(r=0.886，P<0.05)。

3 討 論

宮頸癌的發生發展常需要經歷宮頸上皮內瘤變、原位癌、浸潤癌等階段，與HPV感染、染色體突變、單核苷酸多態性變化等密切相關，是一個多基因參與、涉及多步驟的復雜生物學過程[5]。多項研究表明，miRNA參與細胞增殖與代謝、分化與凋亡等生物學過程，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區的序列互補而在轉錄后水平調控靶基因表達，發揮著類似癌基因或抑癌基因的作用，與人類腫瘤發生和發展密切相關。

本研究結果顯示，miR-34a 在CINⅢ和宮頸癌組織中的相對表達水平明顯低于對照組，同時宮頸癌組與CINⅢ組miR-34a相對表達量比較差異也有顯著性，表明隨著宮頸癌的發生發展，miR-34a的表達逐漸降低，提示miR-34a很可能具有抑癌基因作用。近年來對miR-34a的相關研究逐漸增多，其抗腫瘤的作用機制也不斷被揭示。miR-34家族普遍存在于哺乳動物中，其家族成員包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，具有高度保守性。其主要功能包括誘導細胞凋亡、阻止細胞遷移及促使細胞周期停滯等[6]。作為家族中的一員，miR-34a的異常表達與多種腫瘤的發生與發展密切相關。p53作為一種抑癌基因已被廣泛認知，近年來，越來越多的研究表明，p53與miR-34a關系密切。CASTRO等[7]的研究表明，miR-34a受到p53的直接調控，同時還以正反饋的方式調節p53活性，通過沉默信息調節因子1參與p53介導的細胞凋亡過程。研究證明，在肺癌、腎癌等多種腫瘤中miR-34a有異常表達，起到抑制癌癥發生的作用。

目前，組織及血清中miRNA的表達和相對表達量的檢測技術日趨成熟，而且血清中miRNA具有高度穩定性，具備疾病分子生物標志物的某些特點，使其作為惡性腫瘤的分子標志物成為可能[8-9]。劉秀琴等[9]的研究結果表明，miR-21過表達在急性B淋巴細胞白血病的發病中發揮著重要作用，可作為判斷兒童急性B淋巴細胞白血病預后的指標之一。本文研究結果顯示，組織及血清中miR-34a將為宮頸癌的早期診斷提供一個新的可供參考的指標，其可能具有的抑癌基因作用，有望成為宮頸癌新的治療靶點。

[1] SIOMI H, SIOMI M C. Posttanscriptional regulation ofmicroRNA biogenesis in animals[J]. Mol Cell, 2010,38(3):323-332.

[2] 曾婷,郝麗,謝逸欣,等. microRNA-34a與非小細胞肺癌的關系及其可能調節機制[J]. 中國醫藥導報, 2012,9(23):5-7.

[3] WANG W, LI T, HAN G, et al. Expression and role of miR-34a in bladder cancer[J]. Indian J Biochem Biophys, 2013,50(2):87-92.

[4] LIU C, KELNAR K, LIU B, et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J]. Nat Med, 2011,17(2):211-215.

[5] TSUBOKURA M, KOMATSU T, KAMI M. The prevalence of high-risk human papillomavirus in women with different types of cervical cancer[J]. Ann Intern Med, 2008,149(4):283.

[6] YAMAKUCHI M F M, LOWENSTEIN C J. MiR-34a repression of SIRT1 regulatesapoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(36):13421-13426.

[7] CASTRO R E, FERREIRA D M, AFONSO M B, et al. miR-34a/SIRT1/p53 is suppressed by ursodeoxycholic acid in the rat liver and activated by disease severity in human non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2013,58(1):119-125.

[8] LI B S, ZHAO Y L, GUO G, et al. Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 and miR-218, as novel potential biomarkers for gastric cancer detection[J]. PLoS One, 2012,7(7):e41629.

[9] 劉秀琴,于樹紅,孫立榮. 急性B淋巴細胞白血病病兒miR-21表達及意義[J]. 齊魯醫學雜志, 2014,29(1):1-2,5.

(本文編輯 厲建強)

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MIRNA-34A IN CERVICAL CANCER AND CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA

YUANHui,ZHAOShuping,DAIHongying

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expression of miRNA-34a and its significance in cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ (CINⅢ), squamous carcinoma of the cervix (SCC) and serum.MethodsForty-one patients with SCC (SCC group),27 with CINⅢ (CINⅢ group) and 20 with normal cervix (control group) were enrolled in this study. The small RNA was extracted from their serum and tissues for detection of miRNA-34a expressions using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression levels of miRNA-34a in CINⅢ and cancer tissues was notably lower than that in the normal control, the differences were significant (F=70.26;q=8.36,16.58;P<0.01). The serum level of miRNA-34a in the cancer was lower than that in CIN Ⅲ (F=39.96;q=5.54,7.04;P<0.01), that in CIN Ⅲ was lower than that in the normal control (q=7.08,P<0.01). In SCC patients, the expression levels of miRNA-34a in cancer tissue and in serum were positively correlated (r=0. 886,P<0.01).ConclusionThe abnormal expression of miRNA-34a in tissues and serum of CIN Ⅲ and cervical cancer is likely to play an important role in the occurrence and development of cervical cancer, which has a certain value in the diagnosis of this malignancy.

miRNA-34a; cervical intraepithelial neoplasia; uterine cervical neoplams; polymerase chain reaction

2015-02-22;

2015-04-30

袁匯(1975-)，女，博士研究生。

趙淑萍(1966-)，女，博士，教授，博士生導師。

R

A

1008-0341(2015)04-0457-02