年齡相關性黃斑變性的動物模型

聶 闖，羅 靈，張卯年解放軍總醫院 眼科，北京 0085；解放軍醫學院，北京 0085；解放軍第06醫院 眼科，北京000

年齡相關性黃斑變性的動物模型

聶 闖1,2，羅 靈3，張卯年1,2
1解放軍總醫院 眼科，北京 100853；2解放軍醫學院，北京 100853；3解放軍第306醫院 眼科，北京100101

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)已成為65歲以上人群視力損失的主要原因，是一種年齡、基因、環境等多因素共同作用的慢性疾病，首先表現為Bruch膜的損害，隨后影響到視網膜色素上皮和光感受器。隨著疾病研究的深入，已發現了越來越多的特殊類型，但是其具體發病機制仍不明確。因此研究者們為了更深入地研究疾病以及研發新的治療手段建立了各種各樣的動物模型。我們復習了國內外經典以及較新的動物模型文獻，并按不同疾病類型進行綜述，希望為研究者尋找理想的動物實驗平臺提供思路。

年齡相關性黃斑變性；動物模型；病因學

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是工業化國家65歲以上人群致盲的主要原因[1]。AMD是一種復雜的慢性疾病，涉及到基因、環境等多因素對黃斑結構的共同作用。AMD的發病機制不明，預防和治療仍面臨很大挑戰。AMD主要分為干性和濕性兩型，以及息肉狀脈絡膜血管病變(polypoidalchoroidalvasculopathy，PCV)、視網膜血管瘤樣增生(retinal angiomatous proliferation，RAP)兩個特殊類型。干性AMD比濕性AMD更常見，但是濕性AMD的脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是視力喪失的主要原因[2-3]。動物模型對于研究疾病的發病機制和治療至關重要。理想的動物模型應具有模型簡單、重復性強、經濟及短期就能完整重現AMD特征的優勢。目前用于AMD研究的動物模型很多，但仍未獲得完美的AMD動物模型。本綜述將參考以往的AMD動物模型，按不同疾病類型進行綜述，力圖提供一個綜合的動物模型報告，為研究者尋找不同研究目的的理想動物實驗平臺提供思路。

1 動物的選擇

目前已經建立了嚙齒類動物、兔、豬和靈長類哺乳動物的AMD模型。盡管嚙齒類動物(如小鼠、大鼠等)不具有黃斑結構，但因黃斑是視網膜一部分，類似病變表現同樣可發生在視網膜上，且擁有人類90%的同源基因，實驗費用低，基因操作簡單成熟，同時發病周期較短，有利于我們對AMD疾病特點的觀察[4]。而靈長類動物盡管基因操作困難、維持費用高、疾病進展時間緩慢，但具有與人類最接近的解剖結構[4]。并且在多種基因與藥物有效性的AMD研究中發現，人與鼠存在差異，而與靈長類動物卻具有一致性，這說明了AMD是一種復雜的人猴共患遺傳疾病，可能存在著共同發病機制[5]。因而靈長類動物AMD模型的發病機制更加接近于人類。

2 干性AMD的動物模型

黃斑區出現多種小或中等大小的玻璃膜疣(drusen) (≥63μm且≤125μm)是早期AMD的典型病理特征[6]。干性AMD又稱為無新生血管性AMD，具有以下眼部特征：大面積Drusen(≥125μm)，視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)改變以及地圖狀萎縮。研究者從以下多種途徑建模，觀察到了干性AMD的各種表現，為我們不同因素與AMD相關性的研究提供了思路。

2.1 致病基因模型 目前發現有數種基因的突變能產生黃斑萎縮性損傷或合并有視網膜斑點沉著的AMD，特異性的基因敲除雖然存在基因操作困難、費用高的缺點，但是能獲得遺傳穩定的特異性黃斑病變模型，采用的方式是將已變性或刪除特定疾病相關片段的DNA片段構建成靶向載體，并用電穿孔方式注入胚胎干細胞，將此胚胎干細胞再植入小鼠胚囊內并繁殖，最后用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和DNA印跡法篩選出子代中已刪除或具有此變性片段的小鼠，從而獲得了由該片段變性或缺失引起的小鼠疾病模型。1)敲除Elovl4 5-bp基因后的E_mut+/-鼠模擬出了RPE的空泡狀改變等早期AMD變化，獲得了由ELOVL4的延伸變性引起Stargardt樣黃斑變性的疾病模型[7]。2)Sorsby眼底退化病(sorsby fundus dystrophy，SFD)是一種罕見遲發性的視網膜和脈絡膜變性遺傳病，與TIMPS基因突變相關，Timp3-/-鼠能夠構建此模型[8]。3)補體調節因子H(complement regulatory gene factor H，CFH)SNP基因多態性與AMD發病有關[9]：Cfh-/-鼠模型視網膜下有Drusen樣改變，提示AMD可能[10]。

2.2 易感基因模型 有部分基因雖然不是引起黃斑病變的直接基因，也不會增加AMD的患病風險，但是遭受破壞后動物也會表現出AMD的臨床特征[11]。

AMD與炎癥的相關性一直被認為是相輔相成的，炎癥趨化因子CCL-2與CCR-2結合后能控制組織的滲出，用上述基因技術獲得的CCL2-/-和CCR2-/-鼠發生AMD早期表現，甚至出現CNV[12]；而Luhmann等[13]用同樣方式卻沒有得出AMD模型。因此CCL2/CCR2準確通路仍待深入研究。

血漿銅藍蛋白是一種亞鐵氧化酶，人缺乏此蛋白會出現年齡相關的Drusen和視網膜色素變化[14]，第二亞鐵氧化酶-Hephaestin能部分彌補其損傷[15]。缺失銅藍蛋白和Hephaestin基因的小鼠模型[16]，能表現出多種干性AMD病變，晚期還誘發視網膜下的新生血管[17]，然而，由于運動系統紊亂，很多雙基因敲除小鼠幼時就死亡，限制了對衰老小鼠的研究。

補體因子C3的過度表達能加速補體活化和視網膜疾病的進展。將轉染后表達鼠C3腺病毒注入成年老鼠的視網膜下[18]，表現出RPE萎縮和補體沉積等數種干性AMD的特征，可用于補體參與的疾病與AMD的相關性的研究。

2.3 氧化相關模型 流行病學研究表明，光及吸煙的氧化損傷，將增加AMD的風險[19]。同時經證實，AMD患者具有高水平的脂質過氧化產物[20]。因此，缺乏內在抗氧化機制或給予氧化刺激后動物能表現出AMD的許多特征，可用于研究吸煙以及光損傷與AMD的相關性。

光可誘發視紫紅質、脂褐素等感光分子產生活性氧中間體，對視網膜造成損傷[21]。將SD大鼠暴露在1 000 lux明亮光(BCL)持續照射24 h，構造了萎縮性AMD模型[22]。藍光照射大鼠6 h RPE出現空泡狀改變、細胞固縮、壞死等[23]；Sprague-Dawley白鼠暴露眼A2E氧化產物增加誘導AMD的發生[24]。香煙煙霧中也含有許多強氧化劑如一氧化氮，一氧化碳和氫醌。暴露于香煙煙霧或氫醌的小鼠出現早期AMD，部分動物發生了脈絡膜毛細血管侵入Bruch膜[25-26]。野生型小鼠飲用含氫醌的水后，RPE和脈絡膜上CCL-2表達減少以及VEGF、PEDF比率改變[27]。

Hollyfield等[28-29]用CEP-內收鼠血清白蛋白免疫小鼠進行研究驗證氧化損傷產生的CEP內收蛋白引發AMD這一假設：動物出現Bruch膜沉著增厚，RPE、光感受器的病理性改變，無新生血管發生，表明此模型適用于干性AMD。此模型的優點是不需要進行基因操作和特需的照明條件。

氧化應激會引起視網膜的細胞分子損傷，而此時主要的抗氧化系統為超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)：包括SOD1、SOD2和SOD3[30]，視網膜中SOD1活性最高[31]。實驗證實了SOD1-/-鼠發生干性AMD表現，衰老后表現更明顯[32]。經視網膜下注射AAV核酶介導敲除野生型小鼠RPE的SOD2 mRNA模型[33]，也成功誘導出AMD。此類模型可用于進一步研究不同氧化酶與AMD進展之間的關系。

2.4 飲食模型 眾所周知，高糖高脂飲食在心血管疾病中是危險事件[34]，經證實人玻璃膜疣中存在進展期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)[35]。而動脈粥樣硬化斑塊中膽固醇和脂質的沉積，類似于Bruch膜堆積的物質，因此心血管疾病和AMD患病之間可能存在著相關[36]。進行低血糖指數(glycemic index，GI)喂食的C57BL/6鼠能夠預防AMD發生，高GI飲食則能構建一種早期AMD損傷模型[37]。另外高脂肪飲食的C57BL/6小鼠年長后發生了基底層的沉著物[25,38]，這與老年性脂質增高而伴隨AMD發生的病程一致。

此外，缺乏類葉黃素和玉米黃素飲食的恒河猴，表現出血管造影窗口缺陷[39]，這與流行病學表明葉黃素和玉米黃素的攝入能夠減少AMD的患病風險結論一致[40]。

2.5 其他模型 加速衰老小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)種系是由AKR/J小鼠選擇性近交產生的，隨后又擴展到9種近交衰老品系(SAMP)和4種抗衰老品系(SAMR)[41]，可以不受動物年齡影響較早出現實驗期望的AMD病理改變。其中SAMP1小鼠出現年齡相關的Bruch膜增厚和RPE改變[42-43]；SAMP8小鼠早期發生RPE基底膜微絨毛的斷裂，之后出現嚴重的RPE退化[42]。

3 濕性AMD

CNV是滲出性AMD的標志性病變，也是老年人視力喪失的一個重要原因[9]。目前大多數動物模型制作依賴于激光或RPE/Bruch膜復合物的直接機械損傷或網膜下腔注射外源性化合物。

3.1 激光損傷模型 激光造模能很快地誘發新生血管[44]，還具有定量、重復性好、容易觀察等優勢，在CNV研究中應用較廣。用激光破壞Bruch膜誘導CNV最早應用于靈長類動物，特別是斷尾的短尾猴(獼猴屬)(Macacaspeciosa)[45]。近期對非洲綠猴的激光參數研究表明，750 mW和950 mW激光分別可產生72.9%和69.4%的Ⅲ級損傷；950 mW和1 500 mW激光產生Ⅳ級損傷的發生率分別為19.4%和31%[46]。40%激光損傷眼出現了血管生長和Ⅳ級滲漏[47]，此模型為激光損傷研究分級提供了參考。然而，激光造模最多的動物卻是嚙齒動物。早在1989年Dobi等[48]第一次用氪激光對大鼠造模時認為，120 mW的激光能有效誘導Bruch膜斷裂并產生CNV。近期的Askou等[49]使用綠光氬激光誘導小鼠CNV，認為光凝部位出現氣泡時為Btuch膜斷裂標志，利于CNV的形成。大鼠和小鼠激光后CNV的發展時間相似，第一周為早期階段，10～14 d發展為成熟膜[50-51]。但嚙齒動物激光創傷模型也許不能反映人類疾病誘發CNV的一系列復雜動態過程。此外，嚙齒動物還與人還存在黃斑解剖差異。激光模型所造成的細胞反應與人發生CNV時新生血管變化相似，但是這種機械性損傷導致的CNV是迅速的，而且是自限性的，往往伴有視網膜不可逆的灼傷[52]。

3.2 視網膜下注射模型 視網膜下注射多采用自睫狀體扁平部進針，通過玻璃體達到視網膜下，注射誘發CNV的物質。因為血管內皮生長因子在新生血管性CNV中的核心作用早已確定[53]，但VEGF蛋白的作用時間段，單純注射VEGF蛋白是不能建立可用的動物模型。為了達到持續表達的目的，Baffi等[54]和Spilsbury等[55]制備了表達VEGF的腺病毒載體從而成功塑造了CNV模型。

除了病毒載體，基質膠也是常采用的方法?；|膠是一種注入體內后能轉化為固體并緩慢釋放血管生成因子的蛋白混合物[56-57]。基質膠單獨注射或聯合VEGF注射，產生100%的CNV病變，并能成功模擬出人滲出性AMD中參與新生血管反應的相似細胞組分[58]。Drusen含有補體成分且與CFH有關[59]，因此通過注射能活化視網膜下補體系統的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-8)創建新的CNV模型：第3天新生血管即可穿透Bruch膜，第5天出現完整的新生血管和視網膜退化[60]。最近羅靈等[61]發現了視網膜光感受器和角膜無血管特性的重要保護因子，即VEGF受體1(sFlt-1)，利用其可降低VEGF血管生成的作用，通過視網膜下注射攜帶shRNA序列靶向敲除sFlt-1的腺病毒載體后，誘發了CNV。這種CNV在眼內長期存在，并在注射后6周左右，在遠離注射部位的正常視網膜也出現繼發性CNV，可排除注射產生機械性損傷的干擾。

3.3 基因模型 缺乏IL-27的EBI3缺陷小鼠，在激光損傷后，比C57BL/6小鼠表現出更多的CNV[62]，因而能更加容易快速地制備動物模型。羅靈等[61]用條件靶向基因敲除的方法，成功制備了轉基因CNV的動物模型，通過VMD-Cre與Flt-1 loxp/loxp鼠雜交，靶向敲除色素上皮細胞的VEGF受體1，誘導出CNV模型。此種CNV發病年齡早(＜28 d)，CNV的病灶大小不一[61]。此方法能夠在遺傳水平純化穩定的提供CNV模型，不用篩選即可直接進行藥物等干預實驗。

3.4 手術模型 Bruch膜的破壞是新生血管形成的必要條件[63]。Kiilgaard等[64]將Danish Landrace豬眼RPE進行手術切除，并對Bruch膜行機械化損傷，誘發了CNV。而有研究發現，不先行RPE清除的Bruch膜穿孔處理是誘導CNV發生的最可靠方法[65]。此外，脈絡膜上腔是血管生成物質的傳遞和基因治療載體的另一個潛在空間[66]。Zahn等[47]經鞏膜切口用睫狀體分離鏟進入兔眼脈絡膜上腔并植入浸潤有VEGF顆粒，在第2周出現新紅色的CNV和滲漏。雖然手術模型具有減少神經視網膜損害的優勢，但該技術成本較高，且受熟練的手術操作的限制。

4 特殊類型PCV和RAP

PCV以內層脈絡膜出現非正常的囊樣薄壁血管擴張是其主要特征[67]。因為PCV為一種特殊的亞型，因此此類動物模型較少。2008年，Lee等[68]研究發現，HTRA1的rs11200638的單核苷酸多態性與華人PCV的危險高度相關。Jones等[69]通過給鼠表達人HTRA1的轉基因處理后，誘導出了PCV的主要病理特征：脈絡膜分支血管網，息肉狀病變，脈絡膜血管彈力層和中膜的衰退。衰老的HTRA1鼠發生了隱蔽的CNV。實驗結果表明，HTRA1的增加足夠誘發PCV，同時也是CNV的一個重要的危險因素。

RAP占新生血管性AMD患者的12%～15%，主要表現為神經視網膜自身血管的增殖，逐漸向視網膜下生長合并或不合并色素上皮的脫離，最終產生CNV[70]。大家都希望基因缺陷模型能夠帶來遺傳穩定的實驗動物來源：極低密度脂蛋白受體基因的敲除和突變模型成功模擬出了RAP，因其激活視網膜血管內皮細胞且促進體內外的血管生成[71]。CCDKO鼠模型(Ccl2/Cx3cr1雙基因敲除小鼠)視網膜外核層下早期即出現類似于視網膜毛細血管擴張的病理改變[72]。靶向敲除光感受器的VEGF受體1，也能誘導出RAP模型[61]。

5 結語

不同模型具有不同的特征和局限。激光模型具有快速成模、定量、重復性好、容易觀察等優勢，視網膜下注射模型多用于某種基因或細胞因子的功能學的研究，但是這兩種模型需熟練的顯微操作技術，且同時機械性外傷本身能誘發新生血管，因此與人自發AMD的病理機制是相背離的?；蚰Ｐ鸵蚰茏园l產生AMD，排除了物理性損傷因素，因此更接近AMD的發病特點并能直接體現相關基因的功能，但是造模技術復雜，形成CNV的時間長短各異。飲食或環境干預可以評估不同的風險因素，但是存在造模耗時相對長的局限。這些模型都為黃斑變性研究提供巨大幫助，研究者可以根據實驗目的從中選擇適合的動物模型。

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Animal models in research on age-related macular degeneration

NIE Chuang1,2, LUO Ling3, ZHANG Maonian1,2
1Department of Ophthalmology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;3Department of Ophthalmology, The 306th Hospital of PLA, Beijing 100101, China

ZHANG Maonian. Email: zmn301@sina.com; LUO Ling. Email: ling.luoling1208@gmail.com

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the individuals older than 65 years. It is a complex chronic disease influenced by age, genetic and environmental factors. AMD begins in Bruch's membrane and progresses into the retinal pigment epithelium and ultimately the overlying photoreceptors. It has several subtypes. Its etiology still remains unclear and its therapy is still a big challenge. Recently, there are several AMD animal models have been established for research. This article reviews these diversity of animal models, both on their advantages and limitations, in order to provide some details for further study.

age-related macular degeneration; animal models; etiology

R774.5；R-331

A

2095-5227(2015)03-0294-05< class="emphasis_bold">DOI：1

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.026

時間：2014-11-27 10:43

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141205.1041.002.html

2014-07-11

國家自然科學基金項目(81271016)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81271016)

聶闖，女，醫師，在讀博士。研究方向：玻璃體視網膜疾病。Email: liz137@163.com

張卯年，博士，教授，主任醫師，博士生導師。Email: zmn301@sina.com；羅靈，女，副主任醫師，出站博士后。Email: li ng.luoling1208@gmail.com