反相高效液相色譜法快速測定竹節參中齊墩果酸的含量

王黎，王文娟，高蘇亞

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

竹節參別名竹節三七、竹節人參、竹根七等，為五加科人參屬植物竹節參Panax japonicus C. A.Mey.的干燥根莖，始載于《本草綱目拾遺》，是人參屬當中的一野生品種，民間將蒸熟的肉質根作滋補藥，生曬根莖作止血藥具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等功效，臨床上常用于病后虛弱、勞嗽咳血、跌打損傷等［1-2］。其化學成分以皂苷類為主，齊敦果酸為主要苷元［3］。目前，中國藥典收載該藥還未有含量測定項，僅對有效成分進行了薄層色譜鑒別。本文采用反相高效液相色譜法對竹節參中皂苷類成分齊敦果酸的含量進行快速測定，為竹節參藥材的質量控制與評價提供了一定依據。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

齊敦果酸對照品(98%);竹節參藥材(產地云南)，經西安醫學院生藥教研室馮永輝副教授鑒定為正品竹節參Panax japonicus C.A.Mey;甲醇，色譜純;水為三重蒸餾水。

P-680 型高效液相色譜儀;UV-170 型紫外檢測器;BSA224S-CW 型電子天平;SB-5200DT 型超聲波清洗機。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定齊敦果酸對照品2.36 mg 于2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成1.18 mg/mL 對照品溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，制備對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備［4］精密稱取干燥后的竹節參藥材粉末1.0 g，以研缽研為粉末后，過60 目篩，置于具塞錐形瓶中，向其中加入50 mL 甲醇，稱定重量，于功率250 W，頻率50 kHz 的超聲中放置40 min，稱定后用甲醇補足所減失重量，搖勻，濾過;精密量取續濾液10 mL，回收溶劑至干，加25%鹽酸20 mL、三氯甲烷25 mL 至殘渣中，加熱水解1.0 h，再用三氯甲烷振搖提取2 次，每次25 mL，合并提取液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，取續濾液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱為Kromasil C18柱(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(93 ∶7)，檢測波長為215 nm，流速為1.0 mL/min，理論塔板數以齊墩果酸色譜峰計不低于5 000，見圖1。

圖1 反相高效液相色譜圖Fig.1 RP-HPLC chromatogram

2.2 線性實驗

精密吸取齊墩果酸對照品溶液2，4，6，8，10，15，20 μL，按上述色譜條件進樣，測定其峰面積值，以峰面積積分值的常用對數(lgY)為縱坐標，以標準品進樣量的常用對數(lgX)為橫坐標進行回歸分析(Y=7.415 7X－0.811 5，r=0.999 8)，結果表明，齊墩果酸在2.36 ～23.60 μg/mL 范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度實驗

取齊敦果酸對照品溶液，按上述色譜條件以進樣量20 μL 重復進樣6 次，取得齊墩果酸峰面積測定結果平均值為117.612，RSD 為1.00%。

2.4 穩定性實驗

取竹節參供試品溶液，分別放置于0，2，4，6，8 h按上述色譜條件進樣10 μL 進行測定，齊敦果酸峰面積的RSD 為0.91%，表明該樣品溶液在8 h 內測定穩定。

2.5 重復性實驗

精密稱取同一批待測竹節參藥材粉末5 份，分別按1.2.2 節方法制備為供試品溶液，按上述色譜條件進樣10 μL 進行測定，所得齊敦果酸峰面積的RSD 為0.63%，表明本方法重復性良好。

2.6 回收率實驗

精密稱定竹節參藥材粉末0.2 g(已知齊墩果酸含量48.28 mg/g)6 份，分別按已知含量的80%，100%，120%加入齊墩果酸對照品溶液，按1.2.2 節方法制備樣品溶液并測定，計算得齊墩果酸平均回收率為98.86%，RSD 為0.41%，結果見表1。

表1 竹節參中齊墩果酸回收率實驗(n=6)Table 1 Recoveries of Oleanolic acid in Panax japonicus

2.7 樣品含量測定

取竹節參藥材待測樣品按1.2.2 節方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣20 μL 進行測定，按外標法計算含量，結果表明該產地云南的竹節參藥材中齊墩果酸平均含量為48. 277 mg/g，結果見表2。

表2 待測云南產竹節參中齊墩果酸含量測定結果Table 2 The assay results of Oleanolic acid in Panax japonicus

3 討論

3.1 檢測波長的優化

采用UV 檢測器對齊墩果酸對照品溶液進行全波長掃描，在210 nm 處出現最大吸收，但210 nm 檢測時基線不平穩、溶劑峰干擾大、檢測器響應值小。為了優化檢測效果、減少干擾、提高信噪比，選擇在215 nm 處檢測，基線平穩且峰形滿意。

3.2 流動相的優化

分別以甲醇-0.2%乙酸水溶液、甲醇-1%乙酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水為流動相來進行測定，結果此四種流動相體系所得的峰對稱度較差，然后將其中的甲醇改為乙腈，當選用乙腈-水的流動相體系時，峰形較好。以乙腈-水的體積比分別為86∶14、88∶12、90∶10、93∶7 作流動相進行測定，發現流動相比例為86∶14 時峰形對稱度較差，88∶12 時對照品后有一小峰且無法分開，90∶10 時峰形對稱度有所改善但保留時間不夠穩定(在6.0 ～7.5 min 之間波動)，93∶7 時不僅峰形對稱度高且分離效果較好、基線平穩，故將最終的流動相確定為乙腈-水(93∶7)。

4 結論

本文建立了以高效液相色譜法測定竹節參中三萜苷元齊墩果酸含量的方法，系統適用性實驗表明選擇乙腈-水的流動相體系符合中藥材主要成分含量測定的要求;方法學考察表明該法快速準確、簡單易行、重現性好，為竹節參藥材的質量評價提供了一定依據。

［1］ 王慧清. 中藥材產銷［M］. 成都:四川科學技術出版社，2004:320-322.

［2］ 國家藥典委員會.中國藥典2005 年版［M］.北京:化學工業出版社，2005:93.

［3］ 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草［M］.第五卷.上海:上海科學技術出版社，1999:832-834.

［4］ 袁丁，何毓敏，魯科明，等. 中藥竹節參中總皂苷和齊墩果酸的含量測定［J］. 西北藥學雜志，2008，23(5):279-280.