神經降壓素類似物的固相合成

王小青，李松濤，宮聞婧，尹志峰，王良友

(1.承德醫學院 河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北 承德 067000;2.承德天創生物制品有限公司，河北 承德 067000)

神經降壓素(NT)是1973 年美國生理學家Carraway 和Leeman［1］在分離牛的下丘腦P 物質時，發現的一種能使毛細血管通透性增加、皮下血管擴張以及短暫降低動脈血壓的物質。NT 由13 個氨基酸殘基組成，氨基酸序列為pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，具有廣泛的生物學功能［2-5］。NT 具有開發成為安定藥、鎮痛藥和降壓藥［6-7］的應用前景。同時，NT 具有高活性、作用快速等特點，能迅速降低人或動物的血壓，在軍用失能劑開發方面具有一定的潛力。

NT 游離羧基端是受體主要結合部位，決定其生物活性。在血液循環和組織中，NT 被作用于羧基端的金屬內切肽酶緩慢滅活，主要降解部位是Arg8-Arg9，Pro10-Tyr11及Pro7-Arg8三處肽鍵［8］。NT 作為軍用失能劑開發，需作用迅速，持久，并且不易失活。本文設計將神經降壓素的Pro7替換成Ser7，可能會避免被金屬內切酶識別而失去活性，以Fmoc 固相合成策略，合成了神經降壓素類似物(Neurotensin analogue，NTA)，氨基酸序列pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Ser-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，分子量1 663.1，并優化了裂解條件，為進一步研究其降壓活性提供物質基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Wang Resin(替代度為1.14 mmol/g)，天津南開合成科技有限公司;Fmoc 保護的氨基酸包括Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-pGlu-OH，Fmoc-Ile-OH 均購自成都誠諾新技術有限公司;縮合試劑1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)由蘇州中科天馬肽工程中心有限公司提供;醋酸酐、哌啶、三氟乙酸(TFA)、甲醇、二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙醚均為分析純;乙腈，色譜純;超純水，實驗室自制。

Agilent Technologies 1200 型高效液相色譜儀;Newstyle 型反相高效制備液相色譜儀;Heal Force 純水機;LGJ-18 型冷凍干燥機;TDL-40B 型高速離心機;Spectrum-752 型紫外分光光度計;AR224CN 型分析天平;RE-52AA 型旋轉蒸發器。

2 結果與討論

2.1 固相合成

2.1.1 合成路線 見圖1。

圖1 NTA 的合成路線Fig.1 The synthetic routes of NTA

2.1.2 肽樹脂的制備 在洗凈并干燥的反應柱中，加入0.877 2 g(1 mmol)wang 樹脂，加DMF 通氮氣溶脹30 min，充分溶脹后抽掉DMF，用DMF 和DCM分別洗滌樹脂，抽干溶劑。稱0. 779 g (2 mmol)Fmoc-Leu-OH、0.324 2 g HOBt(2.4 mmol)與0.024 4 g(0.2 mmol)DMAP 溶于DMF，冰浴并加入0.37 mL(2.4 mmol)DIC 活化5 min，加入反應柱反應1.5 h，抽干，分別用DMF 與DCM 洗滌樹脂，并進行替代度檢測，加入11 mL 的醋酸酐與吡啶(V/V，6 ∶5)混合液封閉14 h。沖洗樹脂，加甲醇收縮2 次(5 min/次)，減壓干燥至恒重，得干燥樹脂。按照合成路線，依次偶聯氨基酸，甲醇收縮樹脂，抽干并稱重得肽樹脂1.55 g。

2.1.3 裂解與沉淀 置上述肽樹脂于茄形瓶中，加入裂解液TFA/間甲酚/EDT(95 ∶3 ∶2)16 mL，室溫下反應2 h。脫脂棉過濾，用少許TFA 洗滌樹脂，將濾液傾入160 mL 無水冰乙醚中，析出白色固體，0 ℃靜置沉降20 min。4 000 r/min 離心4 min，棄去上清液，重復5 次，真空干燥至恒重，得(1)粗肽1.13 g。

2.2 粗肽分析

2.2.1 高效液相色譜分析 色譜柱Agela C18 柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流動相:A 水(0. 1%TFA)，B 為乙腈(5% 水，0. 1% TFA)，B 相5% ～95% 梯度洗脫20 min，進樣量為5 μL，流速 為0.8 mL/min，檢 測 波 長215 nm。粗 肽 純 度 達91.82%(面積歸一化法)，分析結果見圖2。

圖2 粗肽高效液相分析圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of the crude peptide

2.2.2 質譜分析 取適量粗肽進行ESI-MS 分析，可知雙電荷離子峰為m/z 832.5［M+2H］2+與理論值832.56 一致，三電荷離子峰m/z 555. 3［M +3H］3+與理論值555.37 一致。分析結果見圖3。

圖3 ESI-MS 分析圖譜Fig.3 The chromatogram of ESI-MS

由圖3 可知，氨基酸序列中含有2 個Arg 與1個Lys，在進行ESI-MS 鑒定時，易失去兩個到三個H，從而帶有兩個到三個電荷，即［M +2H］2+與［M+3H］3+。

2.3 純化與轉鹽

(1)粗肽稱重，50%乙腈超聲溶解，0.45 μm 有機微孔濾膜過濾，經制備型RP-HPLC 分離純化，色譜柱Hedera ODS-2(20 mm ×250 mm，10 μm)制備柱。流動相:A 為水(0.3% HAc)，B 為乙腈，流速為15 mL/min，B 相22% ～32%梯度洗脫30 min，檢測波長215 nm。分段收集主峰，合并經RP-HPLC檢測純度＞98%的組分，減壓濃縮除去乙腈，冷凍干燥得(1)純品0.665 g。分析圖譜見圖4，多肽總收率= 純肽實際重量/理論量× 100% = 665 mg/1 mmol×1 663.1 g/mol=39.99%。

圖4 NTA 純化后分析圖譜Fig.4 The HPLC chromatogram of NTA

2.4 結構確證

取(1)純品進行ESI-MS 分析，可知雙電荷離子峰為m/z 832.5［M+2H］2+與理論值832.56 一致，三電荷離子峰m/z 555. 3［M + 3H］3+與理論值555.37 一致。

2.5 裂解體系的選擇

稱取100 mg 縮合后的肽樹脂，反應溫度30 ℃，不同比例的裂解試劑分別反應2 h，所得結果見表1。

表1 裂解體系對粗肽收率的影響Table 1 The cleavage reagent affects the yield of crude peptide

由表1 可知，采用方法3 TFA ∶EDT ∶間甲酚(95 ∶4 ∶1)切割試劑的配方，可以取得最好的切割效果。NTA 的Fmoc 保護氨基酸側鏈保護基主要有tBu、Boc、Pbf 與Trt 四種，TFA 對tBu、Boc、Pbf 與Trt幾種保護基的脫除均有較好的捕獲效果，同時EDT與苯甲硫醚能增強對tBu 裂解時產生的碳正離子的捕獲，間甲酚能夠更好的防止切割捕獲不完全造成的粗肽純度降低的問題。

2.6 肽樹脂與裂解試劑比例對粗肽收率及純度的影響

以TFA∶間甲酚∶EDT 為裂解體系，對不同肽樹脂與裂解試劑的比例進行實驗，考察料液比對粗肽收率的影響，結果見表1。肽樹脂與裂解試劑為1∶10 時粗肽的收率及純度較好。

表2 料液比對粗肽收率的影響Table 2 Liquid ratio affects the yield of crude peptide

3 結論

本文采用Fmoc 固相多肽合成方法，以Fmoc 保護氨基酸為原料，Wang Resin 為載體，經DIC/HOBT縮合，TFA/間甲酚/EDT 裂解體系脫除保護基，經RP-HPLC 純化并轉為醋酸鹽。獲取了經RP-HPLC分析為單一峰的目的肽，總收率為39.99%。

［1］ Caryaway R E，Leeman S E.The isolation of a new hypotensive peptide，neurotensin from bovine hypothalamus［J］.Biol Chem，1973，248(19):6854-6861.

［2］ 陳家津.功能性頭痛病人腦脊液中神經降壓素含量的改變［J］.中國應用生理學雜志，1992(1):74-75.

［3］ Gullo L，Pezzilli R，Tomassetti P，et al.Plasma cholecystokinin and neurotensin after an ordinary meal in humans:A prolonged time study［J］.Gastmenteml Clin Biol，1998，22(1):25-28.

［4］ Collier N A，Weinbren K，Bloom S R，et al. Neurotensin secretion by fibrolameler caroinoma of the live［J］. The Lancet，1984(1):538-540.

［5］ James M B，Leina A R，Kevin J，et al.The neurotensin receptor-1 promotes tumor development in a sporadic but not an inflammation-associated mouse model of colon cancer［J］.Int J Cancer，2012，130(8):1798-1805.

［6］ Zadina J E，Hackler L，Ge L J，et al.A potent and elective endogenous agonist for the mu-opiate receptor［J］. Nature，1997，386:499-502.

［7］ 吳蕾，任云霞，景文鵬.神經降壓素的固相合成工藝研究［J］.化學工業與工程，2009，29(4):292-296.

［8］ Kitabgi P，DeNadai F，Rovere C，et al.Biosynthesis，maturation，release，and degradation of neurotensin and neuromedin N［J］. Annals of the New York Academy of Sciences，1992(668):30-42.